养殖河蟹弧菌病病原菌分离鉴定及其胞外产物的致病性

从杭州-养蟹场的病蟹体内分离到3株细菌,经形态学检查,生化性质测定,鉴定为副溶血弧菌,人工感染健康触,48h内均发生死亡,死亡率100%,证实副溶血弧菌为河触的致病菌。药敏试验结果表明,此病原菌对链霉素,利福平,卡那霉素,复方新诺明,环丙沙星,氟哌酸,四环素,氯霉素,氟嗪酸,复达欣,菌必治,萘啶酸等药物高度敏感。分离菌株培养物经理化方法处理获得的胞外产物蛋白具有明胶酶,几丁质酶,淀粉酶,酪蛋白酶,脂酶,磷脂酶等多种酶活性及溶血活性,并对河触具有明显的致病作用。     

养殖河蟹弧菌病病原茵分离鉴定及其胞外产物的致病性

从杭州一养蟹场的病蟹体内分离到3株细菌,经形态学检查、生化性质测定,鉴定为副溶血弧菌。人工感染健康蟹,48h内均发生死亡,死亡率100％,证实副溶血弧菌为河蟹的致病菌。药敏试验结果表明,此病原菌对链霉素、利福平、卡那霉素、复方新诺明、环丙沙星、氟哌酸、四环素、氯霉素、氟嗪酸、复达欣、菌必治、萘啶酸等药物高度敏感。分离菌株培养物经理化方法处理获得的胞外产物蛋白具有明胶酶、几丁质酶、淀粉酶、酪蛋白酶、脂酶、磷脂酶等多种酶活性及溶血活性,并对河蟹具有明显的致病作用。     

高致病性维氏气单胞菌胞外产物对斑点鲖的致病性

为了研究维氏气单胞菌及其胞外产物的致病机制对预防和治疗斑点鲖维氏气单胞菌病的作用。通过对一株高致病性斑点鲖源维氏气单胞菌胞外产物(extracellular product,ECP)的提取并结合体内外实验研究其酶活性与致病性,以期为维氏气单胞菌的致病机制研究提供新思路。采用饱和硫酸铵沉淀法,对一株高致病性的斑点鲖源维氏气单胞菌的ECP进行了提取,将其进行浓度检测、SDS-PAGE分析和酶活测定;并将提取的ECP攻毒斑点鲖,通过病理学分析研究其致病机制。提取的ECP经考马斯亮蓝试剂盒确定其浓度为0.743 mg/m L;SDS-PAGE分析发现该ECP类型丰富,分子大小主要集中在20.0~33.0 ku。运用琼脂平板扩散法对ECP中主要毒力和代谢相关酶活性进行体外测定,发现ECP具有脂酶、蛋白酶、卵磷脂酶、DNA酶和溶血活性,不具有淀粉酶、明胶酶、脲酶活性;并对与毒力密切相关的溶血活性进行了进一步的溶血谱绘制,发现ECP对其他多种动物红细胞都有溶血活性,对鱼类红细胞溶血性较强,但对鸡、鸭红细胞无溶血活性。ECP攻毒健康斑点鲖后,发现其具有明显致病性,死亡率高达100%。病鱼大体病理变化为体表黏液增多,出现褪色斑以及不同程度的出血斑;眼球充血;肛门红肿外凸;剖检病变表现:鳃丝充血肿胀、肝脏肿大、散在少量出血点,脾脏肿大暗红,肠道扩张、肠壁变薄、肠腔内有大量黄色黏液。组织学病变主要表现为肝细胞变性、坏死;脾脏淋巴细胞减少,大量结缔组织增生;胃、肠道黏膜上皮坏死脱落。该株维氏气单胞菌的胞外产物具有多种酶活性,且对斑点鲖具有明显的致病性,推测该胞外产物在维氏气单胞菌入侵、感染甚至致死斑点鲖过程中都发挥了重要作用。     

蟹源拟态弧菌胞外产物的细胞毒性和致病性初步研究

本试验对蟹源拟态弧菌(Vibrio mimicus)HX-4菌株胞外产物(extracellular productions，ECP)的细胞毒性和致病性进行了系统研究。采用微量板法检测胞外产物的细胞毒性，结果表明该菌胞外产物对HEp-2细胞具有较强的细胞毒性，病变细胞变圆，脱落；除100℃处理外，经56℃和胰酶处理后，胞外产物仍具有细胞毒性。通过动物实验测定了胞外产物的致病性，结果显示胞外产物对小鼠与中华绒螯蟹均有致死性．致死率均为100％。     

1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质

从山东省莱州海区自然发病的花鲈（Lateolobrax japanicus）体内分离到1株致病性鳗弧菌，经硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex-G100凝胶层析等方法从其培养液中分离纯化了1种胞外蛋白酶。用SDS-PAGE电泳测得蛋白质的分子量为36.7kD，最适温度为50℃，对热不稳定，70℃15min完全失去活力；最适pH为7.0；1mmol/L的PMSF对酶活性无影响，部分金属离子如Cu^2 、Fe^2 、Fe^3 、Zn^2 对酶活力有抑制作用，而Ca^2 对酶有一定程度的激活作用，1mmol/L EDTA能完全抑制酶的活性，表明该酶是1种金属蛋白酶。     

养殖刺参溃疡病杀鲑气单胞菌的分离、致病性及胞外产物特性分析

从患溃疡病的养殖刺参(Apostichopus japonicus)病灶处分离出1株优势菌H1,以浸浴、创伤浸浴、体腔注射和体壁肌肉注射等方式进行感染实验,证实菌株H1为养殖刺参溃疡病病原菌,并证明该菌通过体表创伤侵入的方式感染刺参,以创伤浸浴和体壁肌肉注射感染的LD50(半数致死量)分别为2.26×107CFU/尾和1.80×107CFU/尾。经形态学观察、生理生化特性分析和mini API系统鉴定,确定菌株H1为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida ma-soucida)。提取菌株H1的胞外产物(ECP)进行致病性实验,结果表明ECP可导致刺参死亡,其对刺参的LD50为5.24μg蛋白/g体质量。H1-ECP具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、几丁质酶和淀粉酶活性,并具有溶血素活性;对底物偶氮酪蛋白(Azocasin)作用的酶比活力可达到674.5活力单位/mg蛋白,最适作用温度为50℃;对热不稳定,70℃作用30 min时,酪蛋白酶活性降到0;100℃作用30 min,ECP对刺参的毒性消失;ECP酶活可被10 mmol/L EDTA完全抑制,可被5 mmol/L PMSF抑制98.8%,Ca2 和Mg2 可使酶活性分别提高约9%和4%。结论认为,该病原菌通过体表创伤侵入方式感染宿主刺参,菌株H1胞外产物是其对刺参致病的因子之一。     

哈维氏弧菌TS-628菌株胞外产物(ECP)蛋白酶活性的研究

采用复性电泳技术,研究环境pH、温度及培养时间对哈维氏弧菌TS-628菌株胞外产物(ECP)蛋白酶活性的影响。结果表明,胞外产物蛋白酶最适反应pH在8.5左右,酸对ECP蛋白酶活性的抑制明显强于碱对它的抑制作用;最适反应温度在20～50℃之间,20℃以下或50℃以上蛋白酶活性则受到明显抑制,表明蛋白酶不仅对高温敏感,对低温也很敏感;培养12h的胞外产物蛋白酶活性最强。最适温度和pH条件下,主要出现3种蛋白酶,其中分子量为94kDa和26kDa的两种蛋白显示了很强的蛋白酶活性,而且能在比较极端的温度和pH值条件下保持活性,而分子量为35kDa蛋白酶只在最适反应条件下出现,并且该蛋白酶的最适反应条件与弧菌病暴发时的环境条件极为相似。由此可推测分子量94kDa和分子量为26kDa的两种蛋白可能是弧菌维持生存所必需,而分子量为35kDa的蛋白酶虽然只出现在特定条件下,却可能在致病过程中起重要作用。     

南方鲇源豚鼠气单胞茵胞外产物活性与致病性研究

采用琼脂扩散法测定了南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物酶活性和溶血活性,同时对胞外产物的细胞毒性和其致病性进行了研究。结果显示:南方鲇源豚鼠气单胞菌胞外产物具有蛋白酶、脂酶、明胶酶和脲酶活性,但不具有淀粉酶和卵磷脂酶活性,具有很强的溶血活性和细胞毒性。肌肉注射感染发现,其对南方鲇有强致病性,其LD50为每千克鱼体重0.802 mg;注射后的南方鲇肌肉、心、肝、肾、脾、肠和胃等组织发生了严重组织病理变化,骨骼肌和心肌坏死断裂,炎症细胞浸润;肝脏严重空泡变性;肾小管上皮细胞变性、坏死、间质内大量炎症细胞浸润;脾充血、出血,淋巴细胞减少,胃肠黏膜上皮细胞变性、坏死、脱落。     

黄海希瓦氏菌胞外产物特性研究

为研究黄海希瓦氏菌(S. smarflavi)AP629胞外产物(ECPs)的致病性,用平板玻璃纸法提取胞外产物。结果显示,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)发现ECPs蛋白条带主要在114 kDa、66 kDa、39kDa、36 kDa、79 kDa;ECPs具有酪蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂蛋白酶和脂肪酶活性,无明胶酶活性;一些金属离子和化学试剂对菌株AP629ECPs的酶活有影响,EDTA、PMSF、SDS、MnCl_2作用浓度分别为10、5、5、5 mM时,ECPs酶活受到不同程度抑制;Ca~(2+)和Mg~(2+)则提高ECPs的酶活,可分别提高3%～19%和12%～28%的酶的活性。菌株AP629的胞外产物人工感染小白鼠和仿刺参试验结果表明,黄海希瓦氏菌AP629的胞外产物不显示致病性。该文为揭示黄海希瓦氏菌AP629发病机理奠定了基础。     

乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌抑制作用的研究

分离到对副溶血弧菌有抑制作用的3株乳酸菌,命名为A-1、A-2、A-3。对其胞外产物的抑制作用进行研究,结果表明:3株乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌有较强抑制作用,抑菌环直径分别可达18.6mm、20.3 mm1、9.5 mm;抑菌物质对热处理不敏感:在60℃、80℃抑菌活性基本不变,在121℃处理20min条件下抑菌效果分别是原液的67%,83%,74%,蛋白酶K处理对其活性有较大影响,抑菌成分可能是细菌素。进一步研究了细菌素抑菌活性与乳酸菌培养时间的关系。根据形态特征和常规生理生化反应进行鉴定,A-1、A-2鉴定为嗜热链球菌,A-3鉴定为嗜酸乳杆菌。     

耐盐红螺菌对水产养殖病害细菌的拮抗作用

为探明光合理细菌对水产养殖动物病害的生物防治功能，对病鳖、鳗及南美白对虾动物体上的病原菌进行分离、纯化与鉴定，人工感染健康动物检测致病性；探讨耐盐红螺菌对病害细菌分离株的仰菌效能，和有效抑菌作用时细胞所处的生长期。试验结果表明，水产动物病害细菌分离株为孤菌属，气单胞菌属和假单胞菌属菌株；耐盐红螺菌的代谢产物对商害细菌分离株均有抑制作用，其平坂柳菌圈为1.2-1.4cm，最低抑菌浓度多为4-8倍稀释液；耐盐红螺菌的拮抗物质随细胞对数生长过程中生成，至细胞衰亡期达到最大值。     

莱州湾东部养殖水环境研究

通过对莱州湾东部海域的潮流数值模拟，详细地阐述了莱州湾东部海域的潮汐、潮流特征，特别对该海域的海水交换率与交换期进行了计算。结果表明，莱州湾东部秋季海水交换较夏季要快，而与其他海湾相比，莱州湾水交换能力较差。     

水产品溯源技术研究进展

目前水产品生产中滥用抗生素、以次充好、以假乱真等现象时有发生。水产品溯源技术在保证水产品质量安全方面起着非常重要的作用,利用该技术可以在食品安全事件发生后,第一时间找到问题源头,从而对安全事件进行更好地分析,进而保护消费者的合法权益。文章主要从物理、化学、生物等3个方面对水产品溯源技术的研究进展进行归纳总结,并对水产品溯源技术未来的发展趋势进行了展望。     

水产品中4种常见致病菌多重PCR检测方法的建立及评价

根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、沙门氏菌的侵袭蛋白基因invA、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH和副溶血性弧菌的毒力表达调控基因toxR设计引物,建立一种快速检测水产品中上述4种常见食源性致病菌的多重PCR方法。结果显示,沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌及副溶血性弧菌的多重PCR扩增片段产物大小分别为549、426、348和243 bp,该检测方法具有良好的特异性和灵敏度。设计优化了可用于水产样品中4种目标致病菌的共增菌培养基,该方法应用于35份实际水产样品的检测,并与国标方法对比验证,4种致病菌的整体符合率达94%以上,两种检测方法无显著性差异(P>0.05)。可见,该多重PCR方法可应用于水产品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌及志贺氏菌4种食源性致病菌的快速检测和分子流行病学调查。     

水产食品中甲醛风险评估研究进展

甲醛对人的呼吸、致敏和免疫、神经、内分泌系统均有影响,并有生殖毒性和致癌作用.本文主要从水产食品安全角度,根据风险评估理论,从甲醛对人体健康的危害、暴露评估、风险评估结果的不确定性和风险管理措施诸方面,探讨甲醛与人体健康之间的关系,综述水产食品中甲醛危害风险评估的研究进展.     

方斑东风螺吻管水肿病病原菌的初步研究

从患病方斑东风螺(Babylonia areolata)分离到一株致病菌Balo001,运用生理生化方法并结合分子生物学方法对病原菌进行分类鉴定,并对病原菌进行药敏分析及半致死剂量(LD50)测定.结果表明:致病菌Balo001为哈氏弧菌(Vibrio harveyi),它对东风螺的LD50值为6.8×105 CFU/g;该菌对氟哌酸、氟苯尼考、复方新诺明等抗菌药有较高的敏感性.     

添加营养物质提高商品水质净化菌剂净化能力的研究

利用室内试验,研究了添加营养物质提高商品水质净化菌剂SYMCORE BZTTM的净化能力的方法。研究分两部分,第1部分设1个对照组和2个试验组,研究了添加营养物质对水质净化菌剂的净化能力的影响;第2部分设1个对照组和15个试验组,研究了营养物质添加量配比与净化效果的关系。通过计算葡萄糖和磷酸盐的添加量对COD、NH4+-N和NO2--N去除率的影响,建立了相关模型。实验结果表明,添加葡萄糖和磷酸二氢钾能显著提高水质净化菌剂对养殖废水的净化能力。添加葡萄糖使COD、NH4+-N和NO2--N的去除率分别提高了21.92%、34.43%和57.41%;添加磷酸盐使COD、NH4+-N和NO2--N的去除率分别提高了30.02%、53.45%和15.08%。当C∶N∶P=62.5∶4.85∶1时,水质净化菌剂对养殖废水中COD的净化效果最佳;当C∶N∶P=37.5∶4.51∶1时,对氨氮的去除效果最好;当C∶N∶P=25∶2.97∶1时,对亚硝酸氮的净化能力最高。葡萄糖与磷酸盐的添加量与3种污染物去除率的关系可以用二项式曲线拟合。实验结果与拟合结果相符。为养殖废水的生物修复和微生物制剂的推广应用提供了理论和技术依据...     

5株鲆鲽鱼类病原菌多克隆抗体的制备与应用

本研究制备了鳗弧菌Vibrio anguillarum、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonicida、副溶血弧菌V. parahaemolyticus、哈维氏弧菌V. harveyi和腐败希瓦氏菌Shewanella putrefaciens 5株鲆鲽鱼类病原菌的兔抗血清,建立了5种菌的间接ELISA检测方法,并将该检测方法用于鱼类细菌分离物病原检测。人工感染结果显示,5株菌对大菱鲆的半数致死量(LD50)在102~107CFU/fish;制备的兔抗血清效价分别为1∶2 048 000、1∶16 000、1∶16 000、1∶1 024 000、1∶128 000;交叉反应结果显示,鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌3株弧菌与抗血清相互之间存在交叉反应;抗血清特异检测灵敏度分别为104、108、107、105、106cell/ml;对13株海水鱼类细菌分离物进行检测,有1株腐败希瓦氏菌阳性,两株哈维氏弧菌阳性;1株副溶血弧菌和哈维氏弧菌均为阳性,该结果与16S rDNA序列的分子分析方法一致。     

诺氟沙星对溶藻弧菌和恩诺沙星对迟缓爱德华菌的抗生素后效应

采用试管二倍稀释法测定诺氟沙星对溶藻弧菌s6 2 2、恩诺沙星对迟缓爱德华菌 75 1的最小抑菌浓度(MIC) ;采用菌落计数法测定诺氟沙星对溶藻弧菌、恩诺沙星对迟缓爱德华菌的抗生素后效应 (PAE)。结果显示 ,诺氟沙星对溶藻弧菌s6 2 2在 1/2MIC、1MIC、2MIC和 4MIC浓度时的PAE分别为 :0 .4 7h、0 .76h、1.2 6h和2 .0 5h ;恩诺沙星对迟缓爱德华菌 75 1在 1/2MIC、1MIC、2MIC和 4MIC浓度时的PAE分别为 :0 .2 9h ,0 .4 8h ,1.97h ,2 .30h。结果表明 ,诺氟沙星和恩诺沙星具有明显的PAE ;该结果提示 ,在制定给药方案时可以适当延长给药间隔时间 ,减少给药次数 ,仍能维持抗菌效果。