干旱胁迫下油菜消减文库的构建及分析

以抗旱能力强的油菜Holiday为材料,以干旱处理的样品为Tester,正常水分管理(对照)为Driver构建干旱诱导的甘蓝型油菜叶片正向抑制性消减杂交 (SSH)文库。随机挑选24个阳性克隆进行PCR验证,结果表明,其中23个含有插入片段,平均大小在750 bp左右。将96个阳性克隆测序,并拼接和去除冗余,获得重叠群4条,单拷贝序列82条,平均长度为542 bp。经BlastX程序比对蛋白数据库发现,11条EST没有找到同源性序列,75条有同源序列。KOBAS分析发现,28条EST被定位到67条代谢途径中,根据P值推测,光合中的碳固定、有氧呼吸的电子供体、氮代谢、乙醛酸和二羧酸代谢在植物干旱胁迫中发挥着极为重要的作用。这些EST涉及到的功能中所占比例最大的分别是细胞器(58.82%)、结合(30.77%)和新陈代谢过程(43.72%),表明甘蓝型油菜面对干旱胁迫时,细胞器组件上的功能发挥了重要的作用,结合基因和蛋白被激活,加强了新陈代谢。     

盐碱胁迫下羊草消减文库的构建及分析

以盐碱胁迫下的羊草地上部分cDNA为实验方(tester),非盐碱条件下生长的羊草地上部分cDNA为消减方(driver),利用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建了盐碱胁迫下羊草消减文库.从消减文库中筛选1920个阳性克隆,PCR鉴定插入片段大部分集中在300～800 bp之间.将聚类后得到的552个非重复序列与GenBank中的序列进行比对,其中有548条与数据库中的序列有同源性,其中功能已知的339个,功能未知序列209条.获得了与盐碱胁迫相关的基因,如单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)、铁蛋白(Ferrtin)、水孔蛋白(PIP)、脱水素基因(dehydrin)、14-3-3蛋白等.本实验为抗逆基因的克隆及系统研究盐碱胁迫下羊草相关基因的表达奠定了基础.     

斜纹夜蛾取食诱导棉花抑制性消减文库的初步构建及生物信息学分析

 为了筛选棉花抗逆基因,实验室构建了棉花被斜纹夜蛾幼虫取食诱导的正、反向抑制性消减文库。文库随机各挑取1000个克隆进行PCR鉴定,发现插入片段长度主要集中在200~1000 bp之间。经反向Northern杂交筛选,正向文库随机挑取250个克隆测序,得到了35条非重复序列ESTs,反向挑取150个克隆,得到24条ESTs。GenBank数据库BLAST序列相似性比对功能分析表明,斜纹夜蛾幼虫取食胁迫棉花的应答过程涉及信号传导、基因调控、抗胁迫、防御反应、能量合成代谢、细胞生长延伸等多个生物途径。诱导表达的基因对斜纹夜蛾取食胁迫功能表现为一定的直接或间接保护作用。     

谷子十里香抗锈抑制消减杂交文库构建及初步分析

为了研究十里香抗锈分子机理及其调控机制。以谷子抗锈十里香接种12,24,48,72,96 h叶片为材料,利用抑制差减杂交技术,构建了谷锈菌诱导的SSH文库,筛选十里香接种与未接种锈菌差异表达的基因片段,通过Gen-Bank进行同源比对,对差异表达基因进行功能注释,并利用荧光定量PCR技术对部分差异表达片段进行表达分析。随机挑取差减文库中阳性克隆测序,共获得368个EST序列,插入片段大小为200~750 bp,通过网上GenBank非冗余数据库比对分析,发现其中32个EST与抗病相关。对与抗病相关的EST分析,推测WRKY转录因子、MAPK信号途径、钙信号途径、谷胱甘肽-S-转移酶、细胞色素P450、病程相关蛋白等可能参与了十里香与谷锈菌非亲和互作。进一步利用荧光定量PCR技术对SSH文库中4个基因做了表达分析,结果表明这些基因均受锈菌诱导表达。通过构建十里香受锈菌诱导的SSH文库,初步明确了十里香参与抗锈相关的基因,为下步谷子抗锈分子育种奠定基础。     

小金海棠抑制性消减cDNA文库的构建及文库质量分析

构建小金海棠抑制性消减文库,为进一步大量筛选、克隆苹果铁高效基因、果树转基因工程奠定基础。试验是在提取水培条件下小金海棠缺铁(EDTA-Fe2＋,4μmol/L)和正常供铁(EDTA-Fe2＋,40 μmol/L)的根的总RNA,经过LD-PCR扩增双链cDNA后,利用抑制性消减杂交(SSH)方法,通过两轮杂交和两次抑制性PCR,构建了小金海棠缺铁条件下包含1200个独立克隆的消减cDNA文库。用菌落PCR检测,结果显示插入片段大小范围在300~800bp之间,提取质粒进行PCR和质粒RsaⅠ酶切同样也得到一致性的结果。     

具有斑茅种质的耐旱甘蔗品系的选育

经过固定光照(12h, 25min)和随后的递减光照(递减率15s或30 s/d)等处理, 诱导甘蔗属热带种的Badila、 IJ76-315等品系和甘蔗属中国种的广东竹蔗、江西竹蔗等品系开花, 用作母本; 采取调整种植期、剪叶等措施, 延迟甘蔗属的割手密和蔗茅属的斑茅开花, 用作父本. 实施热带种与割手密, 热带种与斑茅, 中国种与割手密, 中国种与斑     

陆地棉开花后20d纤维抑制性消减文库的构建及分析

本研究以高比强度纤维材料0-153和转基因抗虫棉sGK9708为亲本构建的高代重组自交系群体(F6:9)中选育出的高比强度纤维品系(69307)作为材料,利用抑制性消减杂交技术,以15DPA纤维为driver、20DPA纤维为tester,成功构建出陆地棉开花后20d纤维的cDNA消减文库。通过蓝白斑筛选、菌落PCR及反向Northern技术最终筛选出差异表达的阳性克隆340个。通过对阳性克隆测序及序列分析,共得到115个单一序列,其中35个重叠群,80个单拷贝。利用Blast2GO等对差异表达基因进行生物信息学分析,结果表明这些差异表达基因广泛参与糖类、脂类、氨基酸等物质的代谢,以及纤维素生物合成、细胞壁合成与修饰、氧化还原、细胞信号转导等生物学过程。     

黏类小麦细胞质雄性不育系mtDNA消减文库的构建

本研究利用抑制性消减杂交技术,构建了黏类小麦细胞质雄性不育线粒体DNA的消减文库。分别提取相同细胞质背景下的不育和可育等基因系线粒体基因组DNA(mtDNA),用RsaⅠ酶切成大小不等的片段,并各自与不同的接头连接,连续经过两次消减杂交和两次PCR扩增,将PCR产物与克隆载体连接,转化为大肠杆菌感受态细胞DH5α,经蓝白斑筛选后,再用PCR方法插入片段筛选出阳性重组质粒,构建差异DNA消减文库。在构建的不育mtDNA文库中,将SSH文库的全部扩增产物与SSH文库中的单条扩增条带分别进行胶回收和克隆转化,分别挑取54个和6个阳性克隆进行测序分析和相关功能初步比对。结果表明,不育mtDNA的SSH文库差减杂交效率较高,质量较好;回收单条扩增条带分别进行克隆测序的结果准确率较高;对测序序列进行BLASTx比对及功能注释分析发现,约90%的序列来源于线粒体基因nad1和nad5的非编码区。     

干旱胁迫下棉花SSH文库构建及其抗旱相关基因分析

以耐旱自交系邯郸177为材料,利用抑制性差减杂交技术(SSH),构建棉花苗期叶片的正向差减文库。挑取300个阳性克隆进行PCR验证,并对验证后的单克隆进行测序和分析,共获得284个有效序列。聚类后得到202条uniESTs序列,其中174条singlets,28条contigs。经过BlastN分析,156个unigene可以在GenBank中找到同源序列,46个unigene未能找到同源匹配。经BlastX分析,40个unigene与未知功能蛋白或假定蛋白有较高相似性,116条unigene与已知功能蛋白有较高同源性。用KOBAS系统将33个unigene定位到55个Pathways中,其中P值小于0.5的Pathway有23条。初步分析发现, 丙酮酸盐代谢(pyruvate metabolism)途径、乙醛酸和二羧酸代谢(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)途径与棉花抗旱相关性较大。这些unigene基因涉及信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输等代谢过程。发现了苹果酸合成酶基因(Ms1, 001_B03; Ms2, 003_E04)、苹果酸脱氢酶基因(Md1, 001_C12; Md2, 002_F01);NAC(001_C08)、锌指蛋白(zfp, 003_C06)、BZR1/BES1(003_G04)等转录调节因子,以及翻译控制肿瘤蛋白基因(TCTP,002_C04)等耐旱相关基因。     

低温胁迫下东农冬麦1号分蘖节SSH文库的构建及文库中3个基因的表达模式

为揭示高抗寒冬小麦品种东农冬麦1号的抗寒分子机制,在北方寒地自然条件下,于越冬前(5℃)和越冬期(-25℃) 分别对分蘖节取样,利用抑制消减杂交技术构建该品种低温胁迫相关基因的cDNA文库。在cDNA文库中随机挑选300个阳性克隆测序,获得230条高质量的表达序列标签(EST)。对该序列进行BLAST比对及功能注释,发现文库中基因组成类型复杂多样,其中应对胁迫的基因(如热激蛋白、CS66、Wcor8等)以及参与编码60S和40S核糖体亚基的基因出现的频率较高,这些基因可能与东农冬麦1号的安全越冬有密切关系。对文库中筛选到的2种未知基因和Clp基因进行荧光定量PCR分析,发现其表达水平随着温度降低而不同程度升高;在弱抗寒性小麦品种济麦22中,这些基因则有不同的表达模式。推测这些基因在抗低温胁迫过程中发挥重要作用。     

黏类小麦育性相关基因SSH文库的构建

为了深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制, 利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的cDNA文库。文库质量检测表明, 差减杂交效率较高, 质量较好。在不育和可育cDNA文库中随机挑选120个阳性克隆进行测序, 获得100余条高质量的表达序列标签(EST)。对序列进行BLAST比对及功能注释, 比较了不育和可育cDNA文库的基因表达谱, 发现在可育cDNA文库中参与能量代谢的基因出现频率较高, 在不育cDNA文库中检测到了与花发育调控相关的MADS-box转录因子、细胞凋亡相关的泛素结合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相关基因。这些基因很可能与育性相关。     

抑制性差减杂交(SSH)技术在分离植物差异表达基因中的应用

抑制性差减杂交技术（SSH）是基于抑制PCR作用的cDNA差减杂交，是在转录水平上研究差异基因表达的技术。该技术在一个循环过程中完成差异表达基因丰度的均等化及目标群体和对照群体中相同基因的去除，从而实现差异表达基因的高度富集。一个典型的SSH过程，可在一个差减杂交过程中将稀有基因序列富集上千倍。本文通过详细分析该技术在植物差异表达基因分离中的应用发现：SSH技术主要用于分离组织特异性表达和诱导型表达的基因。首先，SSH技术广泛应用在分离植物发育过程中不同发育阶段和不同组织器官中的组织特异性表达的基因，为揭示植物生长发育过程的分子机理提供了有效手段；另外，在不同植物中，该技术被大量应用于分离各种生物及非生物胁迫条件下诱导表达的抗性相关基因，可以揭示植物抗逆的分子机理。目前，SSH技术己开始应用于分离与次生代谢产物合成相关的基因。SSH技术是分离植物差异表达基因，揭示植物复杂生命现象分子机理的有效方法，将在植物差异表达基因研究中得到更广泛的应用。     

应用抑制性差减杂交筛选副猪嗜血杆菌4型菌株可能毒力基因

为了寻找副猪嗜血杆菌可能毒力基因,采用抑制性差减杂交技术,以HPS有毒力菌株SW124(血清4型)和无毒力菌株H465(血清11型)为研究对象,构建差减杂交文库,利用Southern Blot分析和PCR鉴定进行差异基因片段的筛选。从构建的文库中共筛选得到7个特异性差异基因片段,经同源性分析,其中5个片段分别与噬菌体重组蛋白、糖基转移酶/荚膜多糖磷酸转移酶、磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶、核糖体蛋白丙氨酸转移酶和ABC型硝酸盐/磺酸盐/碳酸氢盐转运系统周质蛋白等编码的基因有同源性;2个差异基因片段与功能未知蛋白或假定蛋白编码基因有关。利用PCR对上述可能与毒力相关的差异基因片段在9种不同血清型HPS中的分布进行了检测,结果表明,7个片段存在于多数的有毒力菌株(血清4,5,12,14,15型)中,而在无毒力菌株(血清3,11型)中均未检测到。利用SSH技术成功构建了HPS有毒力菌株SW124和无毒力菌株H465的差异表达基因差减文库,筛选获得了7个差异基因片段,且上述片段在HPS不同血清型有毒力菌株中分布广泛。     

香蕉果实采后抑制差减文库的构建与鉴定

抑制差减杂交技术(suppression subtracfive hybridization,SSH),是抑制PCR与差减杂交技术相结合而产生的。其优点是在差减杂交过程中使不同丰度cDNA的拷贝数差异趋于均衡,因此不同丰度的差异表达基因都能得到有效克隆,能有效分离低丰度的差异表达基因,避免了表达序列标签分析中高丰度基因重复测序的缺点。因此SSH技术被应用于植物差异表达基因的分离。香蕉果实采后成熟过程中发生一系列复杂的生理变化,这些变化涉及到许多基因的表达。为了研究香蕉果实采后与采前在基因表达上的差异,我们首次采用抑制缩减文库的方法,以分离香蕉果实在采后表达的基因。以采后0h的香蕉果实cDNA为驱动子,对香蕉果实采后48h果实cDNA为待测子,进行抑制缩减杂交,抑制缩减杂交产物与pGEM—TEasy Vecter连接,转化E．coli DH5α,构建了抑制缩减文库。该文库共包含312个克隆,采用PCR方法对文库进行了重组子的鉴定,共有302个重组子。该文库的构建成功为深入研究香蕉果实采后基因的表达奠定了基础,为研究香蕉果实采后成熟的分子生物学机理提供了一个新的思路。     

小麦大粒突变体的SSH文库构建及分析

为了获得控制小麦籽粒大小的相关基因,本研究以小麦大粒突变体8008和烟农15为材料,利用抑制消减杂交技术,构建抑制消减cDNA文库。在双向库中随机挑取20个阳性克隆进行测序,共获得24条EST序列。在GenBank数据库中进行Blast比对和功能分析,12条EST与已知功能基因高度同源,主要包括光合作用相关基因、物质代谢相关基因、RNA功能相关基因等;5条EST序列与未知功能的禾本科作物cDNA片段高度同源,7条EST未能找到同源性匹配。