新疆野扁桃自交不亲和基因Cullin1的克隆及生物信息学分析

旨在为今后研究新疆野扁桃的分子调控奠定良好基础。通过利用Rt-PCR技术及生物测序等方法,从新疆野扁桃的幼嫩叶片中,克隆得到了一个全新的新疆野扁桃Cullin1基因全长c DNA,命名为Pet Cullin1。并进一步的利用在线软件分析发现:Petcullin1基因全长为2677 bp,其开放阅读框2217 bp,该基因的氨基酸共有738个编码,预测得出Petcullin1蛋白的分子式为C3887H6064N1028O1133S34,原子总数为12096,相对分子质量为85814.61,理论推导出其半衰期为30 h,带正负电荷的残留的总数分别是108和113,不稳定指数和平均疏水指数分别为40.19、-0.452,该蛋白属于水溶性不稳定蛋白。     

新疆野扁桃自交不亲和基因SSK1的克隆及生物信息学分析

为了获得新疆野扁桃居群中自交不亲和花粉特异性表达的SSK1基因全长,以新疆野扁桃植物叶片及花粉为试验材料通过rt-PCR技术以及生物测序等技术,克隆得到了一个新的SSK1基因全长c DNA,Pet SSK1。Pet SSK1全长为602 bp,开放阅读框为534 bp,共编码了177个氨基酸,经生物信息学分析,Pet SSK1蛋白的分子式为C910H1421N233O295S6,相对分子质量为20538.0,理论推导半衰期为30 h,等电点为4.52,不稳定指数为41.48,平均疏水指数为-0.567,Pet SSK1蛋白属于水溶性不稳定蛋白。首次从新疆野扁桃植株中克隆得到了SSK1基因全长。通过对该基因的克隆及序列分析,为今后的表达分析以及有效利用该基因获得自交亲和植株奠定了基础。     

新疆野扁桃自交不亲和花粉SFB基因的克隆及生物信息学分析

旨在克隆获得新疆野扁桃自交不亲和花粉SFB新基因,以新疆野扁桃花药为试材,应用分子同源克隆及RT-PCR等技术,并进一步采用在线软件分析SFB基因的蛋白质理化性质,实验成功克隆到了PtSFB5与PtSFB6 2个新SFB基因的cDNA全长,2个基因的cDNA全长分别为1124 bp和1072 bp,分别编码了374和348个氨基酸,2个基因都具有F-Box基因结构,属于F-Box基因家族,预测的相对分子量分别为30787.26和44037.74,等电点为5.93和5.43,均属于水溶性不稳定蛋白。     

丹参SmTIR1基因的克隆及生物信息学分析

生长素受体在植物生长素调控植物生长发育过程中起关键作用,而丹参的生长发育直接影响其品质,但目前有关丹参生长素受体基因的研究仍未见报道.本研究通过克隆获得一条全长1887 bp cDNA序列,并对所获得的克隆序列进行生物信息学分析.丹参生长素受体基因TIR1(命名为SmTIR1)具有典型的TIR1基因结构,通过预测其潜在...     

4种杀菌剂对葡萄灰霉病菌的毒力测定及复配试验

为了筛选出能有效防治葡萄灰霉病的药剂,为葡萄灰霉病的防治和复配制剂的研究奠定理论基础。采用菌丝生长速率法,测定了吡唑醚菌酯、咯菌腈、嘧菌环胺和啶酰菌胺4种杀菌剂对葡萄灰霉病菌的毒力,并研究吡唑醚菌酯和咯菌腈的复配效果。毒力测定结果表明：4种杀菌剂对葡萄灰霉病菌都有较强的抑制作用,咯菌腈的毒力最强,EC₅₀值为0.0845 mg/L;吡唑醚菌酯和嘧菌环胺的抑制作用次之,EC₅₀值分别为3.6023、5.6300 mg/L;啶酰菌胺的抑制作用最低,EC₅₀值为68.2860 mg/L。联合毒力测定和评价结果表明：吡唑醚菌酯和咯菌腈5种混配组合对葡萄灰霉病菌的EC₅₀分别为0.3483、0.5291、0.5741、1.8751、3.9185 mg/L,共毒系数(CTC)分别是397.50、166.64、28.75、4.85、2.24。配比为1:25时增效作用最明显,共毒系数(CTC)为397.50。     

欧李ChCBF1基因的克隆及生物信息学分析

本试验在欧李基因组研究的基础上,利用RT-PCR方法从低温处理的‘农大4号’欧李叶片中克隆到了ChCBF1基因,该基因CDS序列长度为690 bp,编码229个氨基酸的蛋白,分子量为25.10 kD,等电点为4.94,蛋白不稳定指数为58.72。二级结构主要由α-螺旋,延伸链,β-折叠和无规则卷曲构成。启动子分析表明,ChCBF1基因的启动子元件包括低温响应元件、多个光响应相关元件以及激素响应元件等一系列诱导型顺式调控元件。通过氨基酸同源比对和系统发育树分析发现,ChCBF1基因编码的氨基酸序列与桃的相似性最高,达到95%。本研究为后续逆境与休眠诱导相关方面的基因功能验证提供了帮助。     

青花菜BoPGIP1基因的分子克隆及其生物信息学分析

根据GenBank已发表的PGIP基因序列设计引物,通过PCR直接扩增的方法从青花菜 (Brassica oleracea var.italica P)中克隆了一个新的PGIP基因,命名为BoPGIP1.BoPGIP1基因序列全长为1 102 bp,由2个外显子和1个内含子构成,外显子总长为993 bp,编码330个氨基酸序列,分子量为37 kDa.对推导的氨基酸序列进行分析,发现该序列包含5个N-糖基化位点,2个蛋白激酶C磷酸化位点,5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,4个N-豆蔻酰化位点.将BoPGIP1氨基酸序列与数据库中的其他植物PGIP进行同源序列比对,构建系统进化树,发现所比对基因都含有LRR结构,在145位点的LRR结构域在所有物种中极其保守;系统树显示,该序列最先与甘蓝型油菜和拟南芥聚类,其次和棉花、番茄和豆科作物的PGIP聚类,基本符合按形态特征分类的亲缘关系.     

沙棘PEPCK基因的克隆与生物信息学分析

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)是调节植物糖异生途径的限速酶。本研究从沙棘果实的转录组测序结果中筛选出PEPCK基因序列,利用RT-PCR技术对其进行克隆,利用生物信息学相关方法分析其编码蛋白的理化性质和结构特征。结果表明,该基因开放阅读框(open reading frame, ORF)长度为1 989 bp,编码一个由662个氨基酸组成的亲水性蛋白,主要由α-螺旋(30.21%)、β-折叠(17.22%),无规则卷曲(47.13%)和β-转角(5.44%)组成,其ORF序列与克莱门柚(Citrus clementina)同源性最高,氨基酸序列与川桑(Moras notabilis)和洋蓟(Cynara cardunculus var. scolymus)的有较高的同源性。该结果为进一步研究沙棘PEPCK蛋白功能以及揭示植物糖异生途径的调控机制提供理论基础。     

苏云金芽孢杆菌cry1Ea基因的克隆及 生物信息学分析

不同来源的苏云金芽孢杆菌能产生多种多样的晶体(Cry)蛋白。基于这个特性,人们可以通过基因工程的手段向工程菌中转入编码多种Cry毒素的基因来控制虫害。通过DNA重组技术,从Bt HZM2菌株中克隆出了cry1Ea基因,对其进行了生物信息学分析,同源比对结果表明,cry1Ea8基因的核苷酸序列与已知cry1Ea的同源性为99.77%~99.91%,对应的氨基酸序列同源性为99.49%~99.74%。对cry1Ea8基因的分析还揭示出了cry1Ea8及其编码蛋白的一些生物和理化性质。结构域预测表明,Cry1Ea8由3个结构域组成,其中N-末端螺旋状结构域与膜插入与孔隙形成有关,而第二和第三个结构域与受体的结合有关。该研究为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了新的基因来源。     

新疆野扁桃CBF基因启动子克隆及瞬时表达分析

CBF基因主要功能是调控下游大量抗冷基因的表达。CBF基因是植物抗冷途径的枢纽,对增强植物的抗冷能力极为重要。本研究利用染色体步移法得到了新疆野扁桃(Amygdalus ledebouriana Schleche)CBF基因家族成员Als CBF翻译起始位点上游的启动子序列,长度为1 391 bp(Gen Bank登录号:KP662710)。对启动子序列进行生物信息学分析表明,该序列存在启动子的基本元件CAAT-box和TATA-box,并且含有多个与植物非生物胁迫有关的响应元件:ABA响应元件、MYB、MYC结合位点、光应答元件和LTRE低温应答元件等。在烟草叶片中进行瞬时表达的结果表明,该启动子序列具备在逆境胁迫下诱导驱动报告GUS基因表达的功能。本研究可为揭示CBF基因在野扁桃抗寒性、抗旱性等抗逆过程中的作用机理,以及为增强野扁桃CBF基因在扁桃的抗逆性遗传改良中的作用奠定一定的基础,同时对野扁桃的繁育和保护也有极为重要的意义。     

野巴旦杏AlsCBF基因的克隆及生物信息学分析

对克隆获得的野巴旦杏基因AlsCBF进行生物信息学分析,从而为该基因的功能鉴定提供理论基础,以期为新疆巴旦杏的抗寒育种提供基因来源。通过采用RT-PCR和RACE方法从野巴旦杏中克隆到植物抗逆途径关键转录因子CBF基因全长并命名为AlsCBF,GenBank登录号为HQ908653。生物信息学分析表明：该基因全长1171 bp,其中编码区长714 bp,编码237个氨基酸,其蛋白的分子式为C₁₁₅₆H₁₈₃₂N₃₃₂O₃₅₆S₁₅,相对分子质量为26.5581 kDa,理论等电点为6.76,该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主。肽链可能含有8处丝氨酸磷酸化位点,1处苏氨酸磷酸化位点。三维结构预测表明其符合AP2结构域模型特点。本研究通过对AlsCBF基因的生物信息学分析,获得了该基因的相关信息,并与已有研究结果进行比对分析,推测该基因在植物抗寒过程中有重要的作用。     

扁桃CBF2基因的克隆及原核表达

为进一步研究扁桃CBF2 目的蛋白功能,探明CBF2 转录因子在扁桃中的抗寒分子机制,以新疆栽培扁桃(Amygdalus communis L.)‘双软’叶片为材料,通过PCR 技术从基因组DNA 中克隆CBF2 基因,命名为AcCBF2,将该基因片段连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组质粒pET-AcCBF2 并转化E. coli Rosetta(DE3)感受态细胞中进行诱导表达;生物信息学推测显示该基因的开放阅读框(ORF)为717 bp,编码238 个氨基酸,其分子量为26.59 kD,等电点为5.29。系统发育树分析结果显示,AcCBF2 基因与扁桃CBF1、光核桃和桃的亲缘关系最近。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明,该蛋白分子量约47 kD,与预期蛋白大小基本一致。AcCBF2 基因在E. coli Rosetta 中的最佳诱导条件为IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导4 h。     

拟南芥转录因子CBF2的克隆与生物信息学分析

本研究旨在克隆转录因子CBF2并对其进行生物信息学分析得到该基因相关信息。试验以拟南芥基因组DNA为模板,根据GenBank中拟南芥转录因子CBF2(FJ491243.1)已知序列设计引物,回收扩增的目的片段与T-easy载体连接后转入大肠杆菌(E.coli DH5α),经蓝白斑筛选后提取重组体的质粒,经滞后筛选、PCR、酶切鉴定无误后进行测序。经生物信息学分析,该基因全长651 bp,其中编码区长648 bp,编码216个氨基酸,其蛋白的分子式为C₁₀₅₆H₁₆₂₃N₂₉₃O₃₃₃S₁₆,相对分子质量为24.26 kDa,等电点为5.00,该蛋白为亲水性非分泌型蛋白,无信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主。肽链可能含有9处丝氨酸磷酸化位点,6处苏氨酸磷酸化位点,以及2处酪氨酸磷酸化位点。本研究通过对CBF2基因的生物信息学分析,获得了该基因的相关信息,并与已有研究结果进行比对分析,推测该基因在植物抗逆过程中有重要的作用。     

贪铜菌6-5双组分信号系统czcR2-czcS2 的克隆

为阐明贪铜菌6-5的耐镉机理,更有效的治理土壤重金属污染。本研究利用同源序列克隆技术从本研究室筛选的高耐镉菌株贪铜菌6-5中成功克隆出双组分信号转导系统czcR2-czcS2,通过DNA测序及序列比对,结果表明,该扩增产物的DNA序列与耐金属贪铜菌CH34中megaplasmid质粒的czcR2和czcS2基因的同源性分别为99%和98%。czcR2-czcS2彼此相邻,并且转录方向一致,很可能作为一个独立的操纵子控制其他功能基因的表达。并利用生物信息学对该调控基因的一般特性、跨膜区和信号肽进行了预测,该研究为开展更为深入的研究以及制定有针对性的重金属污染治理对策建立了基础,具有重要的理论意义和实际应用潜能。

     

诱导型和组成型表达的冷诱导转录因子CBF1基因表达载体的构建

为研究冷诱导转录因子CBF1(C-repeat-binding-factor)基因对我国优良豆科牧草--苜蓿的抗寒性的改良作用,试验从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中利用PCR方法分离了CBFI基因及其启动子,分别构建了CaMV 35S启动子和来源于拟南芥的CBFI启动子驱动的农杆菌介导的植物转化表达载体,为下一步研究利用CBF1基因改良苜蓿抗逆性奠定了基础.     

结缕草CBF基因的同源克隆及其转基因拟南芥的抗寒性验证

结缕草是优良的暖季型草坪草之一, 主要用于亚热带和热带地区的草坪种植。抗冷性是结缕草栽培范围的限制因子。本研究以日本最北部原产的结缕草品系为材料, 根据其他植物的已知的抗寒基因CBF序列, 通过同源克隆的方法获得结缕草中相对应的同源基因ZjCBF;根据和其他已报告的CBF序列的比对结果, 我们确定ZjCBF基因属于CBF转录因子家族基因中CBF1型基因。利用半定量PCR和实时定量PCR分析该基因在寒冷条件下的表达情况, 发现ZjCBF基因受冷胁迫的诱导, 在4℃处理6 h时表达量最高。在此基础上, 本研究构建了该基因的过表达载体, 并将其转化到拟南芥中, 通过低温冷处理实验发现, 不论是否经过冷驯化, 转基因ZjCBF的植株由于ZjCBF的过量表达都要比野生型植株抗寒性强。     

转CBF1基因地被石竹的抗寒性评价

本研究以4个转拟南芥CBF1基因的地被石竹株系及非转基因地被石竹为材料,通过测定相对电导率、脯氨酸含量及丙二醛含量进行抗寒性评价。研究发现不同低温处理后,转基因株系比对照植株(CK)的相对电导率和丙二醛含量低,而脯氨酸含量高,说明转入CBF1基因后,地被石竹的抗寒性增强了。转基因各株系之间有差异,其中株系27的抗寒性最强。     

大肠杆菌Top10甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因克隆及生物信息学分析

根据细菌中存在的甘露醇-1-磷酸脱氢酶（mannitol-1-phosphate dehydrogenase,mtlD）的基因序列,采用PCR扩增的方法从大肠杆菌（Escherichia coli）Top10中克隆到了mt／D基因（Acession numeber：EU433565）。mtlD开放阅读框为1149bp,编码含有382个氨基酸残基,分子量为41．2kD的蛋白,预测等电点为5．37。mtlD含有38个碱性氨基酸,50个酸性氨基酸,158个疏水氨基酸及72个极性氨基酸。二级结构预测表明该蛋白含约60．47％的α-螺旋、4．71％的β-转角、10．73％的延伸链和20．48％的不规则卷曲。亲疏水性分析显示,mtlD是亲水性蛋白。亚细胞定位分析表明mtlD主要定位于细胞质中。序列分析表明大肠杆菌Top10 mtlD基因与大肠杆菌W3350、大肠杆菌DEC12a和盐生盐杆菌（Halobacterium salinarum）的mtlD基因同源性分别为99％、97％和93％。大肠杆菌Top10mtlD基因的克隆及生物信息学分析为今后对mtlD的进一步深入研究奠定了基础。