PPV感染PK-15细胞后对4种抗病毒细胞因子mRNA转录时相的影响

【目的】了解猪细小病毒(PPV)感染对抗病毒相关细胞因子mRNA转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】对PPV感染PK-15细胞的病变进行了显微观察,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染PK-15细胞后,细胞病毒DNA含量及巨噬细胞炎症蛋白1α(MIP-1α)、转化生长因子β1(TGF-β1)、磷酸甘油酸激酶1(PGK1)和MURR1等细胞因子mRNA相对表达量的变化。【结果】PPV可以快速诱导PK-15细胞产生细胞病变。感染后1 h即可检测到PPV DNA,随着时间的延长,PPV DNA含量逐渐增加,并于48 h时达到峰值,相对含量为1 800左右。MIP-1α和PGK1 mRNA的相对表达量在感染后2 h显著增加,之后下降;TGF-β1 mRNA的相对表达量在72 h时显著增加;MURR1 mRNA的相对表达量在24 h时显著增加,48 h后下降。【结论】PPV感染可引起PK-15细胞抗病毒因子mRNA表达水平升高。     

PCV-2感染对PK-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响

【目的】了解猪圆环病毒2型(PCV-2)感染对PK-15细胞抗病毒相关因子转录时相的影响,探讨宿主-病毒之间的作用关系。【方法】运用荧光定量PCR技术,测定和分析PCV-2感染PK-15细胞后0(未接种病毒),1,6,12,24,48,72 h时病毒DNA含量及细胞因子IFN-βI、FN-γI、FNAR-1I、FNAR-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、MX1、NOS、RNaseL和IRF-3 mRNA转录水平的变化。【结果】PCV-2感染PK-15后1 h就可以检测到病毒DNA,在感染后24 h病毒开始大量迅速增殖,于感染72 h时达到最高峰。与0 h相比,PCV-2感染后IFN-βI、RF-3的表达量在感染12 h时显著增加,其他时间表达量下降;IFN-γ、MHC-Ⅱ的表达量在感染12 h时增加不明显,其他时间表达量下降;感染PCV-2后IFNAR-2、MHC-Ⅰ、MX1的表达量下降;RNaseL的表达量在感染12 h时显著减少,其他时间表达量增加,48 h时表达量增加显著;IFNAR-1的表达量在感染72 h时显著增加,其他时间表达量下降;未检测出NOS的表达。【结论】随着PCV-2病毒含量的增加,以上几种主要抗病毒因子的表达量不明显或有所下降,表明PCV-2感染PK-15细胞后可逃避机体的抗病毒作用机制。     

猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素18转录时相的影响

为了解猪细小病毒(PPV)感染Marc-145细胞后引起细胞炎性反应特别是白细胞介素18(IL-18)的反应,探讨宿主-病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析了PPV感染Marc-145细胞后引起的病毒DNA含量的变化和IL-18的分泌水平.结果表明,IL-18的表达量在1h无明显变化、在3,24h增加...     

猪细小病毒感染Marc-145细胞后对其分泌白细胞介素6转录时相的影响

为了更好地了解猪细小病毒(PPV)感染Marc-145后引起的细胞炎性反应,特别是白细胞介素6(IL-6)的反应,以及探讨宿主与病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析PPV感染Marc-145细胞后病毒DNA含量的变化和IL-6的分泌水平。结果表明,病毒感染后1 h就可以检测到病毒DNA,但病毒量相对较低,在感染48 h达到最高峰,为感染时的170倍左右。IL-6的表达量在感染后1 h、3 h、24 h显著增加,48 h下降至低于对照水平,说明猪细小病毒感染后可引起Marc-145细胞分泌IL-6的增加。     

猪细小病毒感染对猪外周血淋巴细胞抗病毒相关因子转录时相的影响

为了解猪细小病毒(PPV)感染PBMC细胞后引起干扰素及其相关抗病毒细胞因子的反应.运用荧光定量PCR技术,测定和分析了PCV2感染PBMC细胞后引起的病毒DNA含量的变化和细胞因子IFN-β,IFN-γ,IF-NAR-1,IFNAR-2,MHC-Ⅰ,MHC-Ⅱ,MX1,2-5OAS,iNOS,RNaseL和IRF-3分泌水平.研究结果表明,PPV感染引起PBMC细胞胞显著增加IFN-β,IFN-γ,IFNAR-1,IFNAR-2,MHC-Ⅰ,MHC-Ⅱ,MX1,2-5OAS,iNOS,RNaseL和IRF-3分泌,说明PPV感染PBMC细胞可诱导机体的抗病毒相关因子过表达进而发挥抗病毒作用.     

猪细小病毒对猪外周血淋巴细胞分泌猪白细胞介素18转录时相影响的探讨

猪细小病毒体外感染外周血淋巴细胞（PBMC）后引起细胞免疫反应尚不清楚,为了更好的了解猪细小病毒（PPV）感染PBMC后引起猪白细胞介素18的反应,探讨宿主-病毒之间的作用关系,运用荧光定量PCR技术,测定和分析了PPV感染PBMC后引起的病毒DNA含量的变化和猪IL-18的分泌水平。结果猪IL-18的表达量在3,6,12,24 h增加,1,48,72 h下调。可见,猪细小病毒感染可引起PBMC分泌猪白细胞介素18的增加。     

PPV感染Marc-145细胞后对其分泌IL-13转录时相的影响

运用荧光定量PCR技术,测定和分析猪细小病毒(PPV)感染Marc-145细胞后引起的病毒DNA含量的变化和IL-13的分泌水平.结果IL-13的表达量在1,3和24 h明显增加,48 h轻微下调.     

PCV-2感染对PK-15细胞IL mRNA转录水平的影响

【目的】观察猪圆环病毒2型（PCV-2）感染对猪肾传代细胞（PK-15细胞）炎性细胞因子白细胞介素（IL） mRNA转录水平的影响,探讨宿主与病毒之间的作用关系及细胞炎性反应机制。【方法】以未感染PCV-2的PK-15细胞为对照组,运用相对定量PCR技术,测定和分析PCV2感染PK15细胞后,PCV-2 DNA相对含量的变化,以及炎性细胞因子IL-6、IL-8、IL-12p35、IL-12p40、IL-13、IL-17、IL-18 mRNA转录水平在1,6,12,24,48,和72 h的变化。【结果】PCV-2感染后,PK-15细胞的IL-6、IL-13、IL-17、IL-18 的mRNA转录水平在12 h显著增加,24 h后mRNA转录水平下降;IL-8的mRNA转录水平在48 h时最高,为对照组的2.5倍,但72 h时恢复至与对照组水平相当;随着感染时间的延长,IL-12p35、IL-12p40 的mRNA转录水平显著下降。【结论】PCV-2感染后可引起PK-15细胞中IL-6、IL-8、IL-13、IL-17、IL-18等细胞因子mRNA转录水平增加,而IL-12 mRNA转录水平下降,提示PCV-2感染后引起的PK-15细胞炎性反应与其分泌的炎性细胞因子的改变有关。     

山药多糖对PK-15细胞抗细小病毒感染能力的影响

采取一步醇沉和分步醇沉法提取4种山药多糖CYPS总、CYPS40、CYPS60、CYPS80.为研究山药多糖体外抗PPV活性,首先用MTT法测定山药多糖对PK-15的安全浓度;然后分别从125 ug/mL倍比稀释5个浓度,将4种山药多糖以先加山药多糖再加病毒的方式加至PK-15培养体系中,用MTT法检测山药多糖对PPV感染PK-15的影响;实时荧光PCR方法检测PK-15培养体系中PPV含量,观察山药多糖对PK-15清除PPV能力的影响.结果显示,在7.8～125 ug/mL范围内山药多糖组A570值和PPV含量分别显著高于和低于对照组,表明山药多糖可以增强PK-15抵抗PPV感染和清除PPV能力.山药多糖的这种作用效果与其浓度和醇沉浓度有关,山药多糖浓度越高则效果越好,分子量段以CYPS80的增强细胞活性和抗PPV感染效果最好.     

抗猪圆环病毒药物的体外筛选

本试验主要检测抗病毒药物(金刚烷胺、利巴韦林、盐酸阿比朵尔、黄连、金银花、连翘、板蓝根)对猪圆环病毒的有效性,为临床用药提供依据.使用PK-15细胞建立抗猪圆环病毒药物的体外筛选模型,采用MTT法检测,然后计算病毒的抑制率.结果显示:金刚烷胺、利巴韦林、盐酸阿比朵尔、黄连、金银花、连翘、板蓝根7种药物的治疗指数分别是124.9,33.8,33.1,13.8,4.1,4.6,5.0.结果表明7种药物在细胞水平上对猪圆环病毒均有抑制作用,而且金刚烷胺和黄连的效果最显著.     

猪瘟病毒E0蛋白在PK-15中的表达与鉴定

[目的]研究猪瘟病毒(CSFV)E0基因在PK-15细胞中的表达特性。[方法]通过PCR方法克隆了E0基因全长681 bp的片段,连接到真核表达载体p EGFP-C1上,构建出重组质粒并进行双酶切鉴定。[结果]成功构建出重组质粒p EGFP-E0。通过双酶切鉴定,PCR鉴定和测序确定了目的基因大小一致,插入位置完全正确后,利用Lipofecta mine 2000转染试剂盒将重组质粒转染到猪肾细胞PK-15中,转染48 h后在荧光显微镜下观察,可以看到大多数细胞呈现出绿色荧光,说明转染成功。通过G418筛选后,在荧光显微镜下仍能观察到部分细胞能够呈现出绿色荧光,这表明重组融合蛋白p EGFP-E0在PK-15细胞中得到了表达。[结论]获得的能够表达重组融合蛋白的细胞克隆,为进一步大量表达与纯化E0糖蛋白、制备其单抗以及研究猪瘟病毒E0糖蛋白的生物学功能奠定了基础。     

猪细小病毒X株在不同细胞上增殖效果比较

为选择猪细小病毒X株增殖的细胞系,对猪细小病毒X株在ST、PK-15、CEF、Vero细胞系上增殖情况进行比较,观察病变时间和病变情况,并分别测定其TCID50和血凝价。结果表明,猪细小病毒X株在这4种细胞上都能产生细胞病变,在ST、PK-15、CEF、Vero细胞上最先开始出现病变的时间分别为24、36、72和48 h,测其在以上4种细胞上的TCID50分别为10-6.4/0.1 mL、10-5.8/0.1 mL、10-2.1/0.1 mL和10-3.2/0.1 mL,HA分别为1 210、1 28、1 23、1 25,因此,建议选用ST细胞作为猪细小病毒X株的增殖细胞系。     

猪圆环病毒2型诱导PK-15细胞产生IFN-β的信号通路研究

【目的】研究猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)感染PK-15细胞后调控β-干扰素(interferon-β,IFN-β)生成的信号通路,为猪圆环病毒病的发生机理和防治提供理论基础。【方法】将PK-15细胞随机分成5组:对照组、PCV2组、BX795(TBK1/IKKε抑制剂)组、BAY 11-7082(NF-κB抑制剂)组和BX795+BAY11-7082(混合抑制剂)组。BX795组、BAY 11-7082组、BX795+BAY 11-7082组分别用0.5μmol BX795、5μmol BAY11-7082、0.5μmol BX795+5μmol BAY 11-7082预先处理1 h,然后感染PCV2。于感染后3、12、24、48和72 h收集细胞,提取RNA。用荧光定量PCR检测IFN-β、模式识别受体(TLR3、TLR9、RIG-1、MDA-5、DAI)、接头蛋白(TRIF、MyD88、Sting、MAVS、IRF3)的mRNA 含量。【结果】PCV2感染PK-15细胞后,IFN-β的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P0.01),表明PCV2感染可以诱导PK-15细胞生成IFN-β;TLR3的mRNA 含量在48 h显著升高(P0.01),TLR9的表达量在48、72 h显著升高(P0.01);TLR3和TLR9下游的接头蛋白MyD88和TRIF的mRNA 含量在48 h显著升高(P0.01),表明PCV2激活了Toll样受体介导的NF-κB信号途径;MDA-5的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P0.01),RIG-1的mRNA 含量在72 h显著升高(P0.01),MDA-5和RIG-1下游的接头蛋白MAVS、Sting、IRF3的mRNA 含量在48 h显著升高(P0.01),表明PCV2激活了RIG-1样受体介导的IRF3信号途径;DAI的mRNA 含量在48、72 h显著升高(P0.01),表明PCV2亦激活了DNA模式识别受体介导的IRF3信号途径;分别用BX795和BAY 11-7082抑制IRF3和NF-κB介导的信号通路,结果显示NF-κB抑制剂组的IFN-β的mRNA 含量与PCV2组相比无显著性差异(P0.05),TBK1/IKKε抑制剂组的IFN-β的mRNA 含量与PCV2组相比明显下降(P0.05),表明PCV2诱导IFN-β的产生主要由IRF3信号途径调控。【结论】PCV2感染可以诱导PK-15细胞中IFN-β表达量的上调,其上调主要与IRF3信号通路有关。     

猪传染性胃肠炎病毒感染PK15细胞抗病毒相关因子转录变化分析

为研究猪传染性胃肠炎病毒感染与固有免疫之间关系,研究构建含有巴马猪IFN-α1,IFN-β和NF-κB启动子的报告基因载体,将转染上述报告基因的PK15细胞接种TGEV和灭活TGEV后发现,与灭活TGEV相比,TGEV能够诱导IFN-α1、IFN-β和NF-κB报告基因低水平表达;其次,利用荧光定量RT-PCR方法检测接种病毒0、2、6和10 h后PK15细胞中IFN-α1、IFN-β、IL6、TNF-α、ISG56和IRF7转录量,结果表明,TGEV对IL6转录没有影响,而诱导IFN-α1、IFN-β、TNF-α、ISG56和IRF7低水平转录,分别为对照组1.49、1.5、2.2、2.5和1.8倍。