苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及诱导表达

从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)T04A001中提取基因组DNA,通过PCR的方法克隆了几丁质酶chiAC基因(GenBank登录号为EF427670).置换chiAC基因的启动子为T7启动子时,chiAC基因能在IPTG诱导下在大肠杆菌中大量表达,并产生大小约70 kDa的表达产物.     

菊花去饱和酶CmSAD基因的克隆与表达分析

以秋菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)抗寒品种‘星光灿烂’为材料,利用RT-PCR和RACE方法从叶片中克隆△9硬脂酰-ACP去饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase,SAD)基因,命名为CmSAD,Gen Bank登录号为KC529335。该基因cDNA全长1 203 bp,编码401个氨基酸,相对分子质量为45.57 k D,等电点为6.48,编码的氨基酸序列与新疆雪莲同源性最高(80.29%)。通过对该蛋白进行生物信息学分析得出其没有跨膜结构,主要存在于叶绿体基质中,N端含有一段包含60个氨基酸的叶绿体转运肽。通过实时荧光定量PCR研究低温胁迫下叶片和根系中CmSAD基因的表达量变化,该基因在叶片和根系中均有表达。根系中CmSAD基因的表达量随着温度的降低而降低,16℃时表达量最高;叶片中CmSAD表达量随着温度的降低先升高再降低,5℃时最高。随着温度的降低,菊花叶片和根系中CmSAD基因的表达情况表现出一定的差异。CmSAD基因的表达变化与温度有关,为低温胁迫下菊花脂肪酸代谢的分子机理研究提供了基础。     

羊草Class Ⅱ几丁质酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆自然生长于黑龙江省盐碱地的羊草ClassⅡ几丁质酶基因并进行序列分析,为进一步研究几丁质酶基因的生物功能和应用奠定了基础。[方法]构建羊草叶片的cDNA文库,对其进行DNA序列测定和分析,并与GenBank中收录的植物几丁质酶基因序列及编码的氨基酸序列进行同源性比较。[结果]在羊草叶片eDNA文库中克隆出1条全长eDNA片段,片段长996bp,其中,可读框768bp,编码255个氨基酸。编码产物在结构上缺乏CBD和C-端延伸区,具有ClassⅡ几丁质酶的结构特征,其氨基酸序列与黑麦和小麦ClassⅡ几丁质酶具有很高的同源性;构建的pQE—LcChi2重组载体经诱导后表达出一个约27KD的蛋白,与推测的pQE-LcChi2基因编码产物大小一致。[结论]LcHi2基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因。     

紫花苜蓿几丁质酶Class Ⅰ基因cDNA全长克隆及序列分析

依据NCBI中已登录的截形首蓿(Medicago truncatula)几丁质酶基因的一段EST序列(GenBank登录号:AF167323)设计引物,以紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为试验材料,利用RACE技术进行cDNA全长克隆.利用生物信息学软件对该序列进行分析得知:该基因全长1 132bp,其...     

山葡萄几丁质酶基因VCH3的克隆及植物表达载体的构建

利用RT—PCR方法克隆了山葡萄几丁质酶基因VCH3的全长cDNA片段,并将该基因构建到双元载体pBI121质粒35S启动子下游,形成重组质粒pBIVCH3。通过冻融法将该重组质粒转化到根癌农杆菌LBA4404中,获得了植物表达载体。     

中国水仙几丁质酶基因的克隆与表达分析

【目的】克隆中国水仙几丁质酶基因,分析其在水仙不同组织中的表达,为提高中国水仙的抗病性提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆得到中国水仙几丁质酶基因,对其序列及编码氨基酸序列进行生物信息学分析,通过qRT-PCR分析该基因在感染基腐病、病毒病及褐斑病中国水仙根、叶中的表达。【结果】中国水仙几丁质酶基因的cDNA序列长768bp,编码230个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为25.4ku,理论等电点为9.04,为不稳定蛋白,亲水性强,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。该基因编码的蛋白与荷兰芹几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,隶属于糖苷水解酶19家族,与溶菌酶相似超家族基因的保守结构域类似,推测其可能是兼具几丁质酶和溶菌酶的双功能酶。qRT-PCR分析表明,在水仙基腐病、病毒病及褐斑病发病过程中,水仙几丁质酶基因的表达量均显著提高。【结论】成功克隆得到中国水仙几丁质酶基因,推测该基因可能参与了水仙的抗病过程。     

百日草几丁质酶基因片段克隆及其序列分析

[目的]克隆百日草几丁质酶的基因片段,并对其序列进行分析.[方法]以百日草“梦境”系列为材料,提取其叶片总RNA,并根据其他植物几丁质酶基因保守序列设计简并引物,通过RT-PCR克隆百日草几丁质酶基因片段（ZEchi）,并对该基因序列进行分析.[结果]克隆得到的片段长度为227 bp,共编码75个氨基酸残基;核苷酸同源性分析表明,ZEchi与已报道的其他植物几丁质酶基因同源性达70％以上,其中与葡萄的同源性最高,为74％;氨基酸同源性分析表明,该几丁质酶多肽属于18家族几丁质酶,且与已报道的其他植物几丁质酶氨基酸序列具有70％以上的相似性;氨基酸聚类分析表明,该几丁质酶多肽与白车轴草和蒺藜苜蓿的几丁质酶聚类;生物信息学分析表明,由该基因片段编码的多肽为非跨膜蛋白,主要含α螺旋和随机线圈螺旋等二级结构.[结论]该研究为进一步研究几丁质酶基因的功能奠定了基础.     

羊草ClassⅡ几丁质酶基因的克隆及序列分析

1材料与方法 1．1植物材料采摘自然生长于黑龙江省安达市（119°28’E,44°1’N）盐碱地的羊草叶片,-70℃冰箱保存。1．2总RNA的分离与eDNA文库的构建用液氮研磨叶片后,用TRIZOL Reagent（GIBCO BRL）提取总RNA,使用PolyATtract mRNA Isolation Systems（Promega）提取mRNA。然后采用Stratagene提供的cDNA合成体系合成cDNA,体外包装和扩增,构建羊草叶片的cDNA文库。     

经修饰的烟草几丁质酶基因的克隆及多基因香蕉转化载体构建

从烟草中克隆得到1个经修饰的几丁质酶基因chi,将它与1个已经克隆的核糖体失活蛋白基因Cassin以及1个抗病毒的融合基因FBC(CMV香蕉株系的CP基因和BBTV的Rep基因)共同构建在1个表达载体上,得到多基因植物表达载体pYLTAC747NH-c-C-FBC.     

二斑叶螨几丁质酶基因的原核表达及多克隆抗体制备

以制备的二斑叶螨c DNA为模板,克隆二斑叶螨几丁质酶Se Chi基因功能结构域催化区片段,大小为786 bp。将该序列片段克隆到表达载体p ET-32a(+)中,获得多克隆原核表达载体p ET-32a-Tu Chi。重组质粒经酶切测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.6 mmol·L-1IPTG诱导4 h后高效表达约45 ku可溶性重组蛋白;经His亲和层析洗脱和浓缩获得高纯度的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备Tu Chi多克隆抗体。制备的多克隆抗体经Western Blot证实能特异性地识别几丁质酶而不与非特异性蛋白结合。ELISA分析表明制备的抗体效价达1??80 000,效价较高,为进一步研究二斑叶螨几丁质酶相关功能奠定基础。     

菊花CmAP1基因克隆及其植物表达载体构建

[目的]克隆菊花CmAPETALA1基因(CmAP1)并构建植物表达载体,为该基因功能的遗传改良打下研究基础.[方法]采用同源克隆及RT-PCR从菊花叶片中克隆CmAP1基因,运用在线生物信息学分析工具对其核苷酸及氨基酸序列进行分析,利用实时荧光定量PCR对该基因的组织表达差异进行分析,并用双酶切法将目的基因与pCAMBIA1300载体连接,构建植物表达载体.[结果]克隆获得的CmAP1基因(GenBank登录号KU872999)编码区开放阅读框(ORF)长741 bp,编码246个氨基酸;CmAP1蛋白属亲水性蛋白,分子质量约28.3 kD、理论等电点(pI)为8.76,预测该蛋白内含10个磷酸化位点和2个潜在的N-糖基化位点;蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化分析结果表明,CmAP1蛋白与CDM111蛋白的同源性达98%,属MADS-box基因家族A类基因的euAP1分支;实时荧光定量PCR分析结果表明,CmAP1基因在花蕾中表达量极高,在舌状花和筒状花中表达量较低,而在营养器官中仅痕量表达.将CmAP1基因连接到pCAMBIA1300载体上,可成功构建植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1.[结论]CmAP1基因在花的发育及形成过程中发挥重要作用,成功构建获得的植物表达载体pCAMBIA1300-CmAP1可为后期利用基因工程手段改变菊花花形态结构、调控花期及遗传改良打下基础.     

甘菊内参基因CITUA的克隆与表达分析

根据前期工作已获得的甘菊α-tubulin基因EST序列,使用RACE技术获得了该基因的全长序列,命名为ClTUA。生物信息学分析表明,ClTUA基因全长cDNA序列为1 580 bp,编码432个氨基酸残基。利用MEGA40软件对推测的氨基酸序列进行系统关系分析发现,其为植物中Ⅰ类α-tubulin基因。RT PCR分析发现:ClTUA基因不仅在盐、干旱、冷、热、脱落酸和水杨酸各种非生物胁迫下稳定表达,而且在不同生长发育阶段的样本中稳定表达;而作为对照的两个内参基因,ClActin和26S rRNA基因在不同非生物胁迫下表达稳定,但在不同生长发育阶段的样本中表达强度不同。这一结果表明,ClTUA基因的表达稳定性优于ClActin和甘菊26S rRNA基因,可以作为内参基因用于甘菊抗逆性和生长发育过程中基因表达规律研究。      

岷江百合单萜合酶基因克隆与表达分析

以岷江百合花被片为材料,通过RT-PCR方法,克隆单萜合酶基因,命名为LreTPS.该基因包含1770 bp的开放阅读框,编码590个氨基酸,编码蛋白质分子质量为68.18 ku,等电点为5.77.LreTPS编码的蛋白含有单萜合酶蛋白特有的DDXXD、RRX8W保守基序,氨基酸序列N端含有一段转运肽,与其他植物的单萜合酶基因蛋白同源性为40%-50%.系统进化树分析表明,LreTPS基因属于TPS-b亚家族.荧光定量表达结果表明,LreTPS在岷江百合花被片中表达量最高,其次在叶片中,在雄蕊与柱头中微量表达.     

国庆菊继代增殖培养技术初探

为国庆菊的工厂化快繁提供理论依据,选取初代培养完成的国庆菊截取茎段作为外植体,分别以 MS、N6和 White 为基本成分,附加不同浓度细胞分裂素（6-BA）组成12种继代增殖培养基,研究了国庆菊继代增殖培养技术。结果表明：不同培养基培养,第11天开始长新叶,第15天开始长丛生芽,30 d 后增殖情况差异明显,MS 培养基的丛生芽最多,且旺盛;N6培养基的丛生芽较 MS 少但比 White 多且旺盛, White 培养基的丛生芽最少且最弱。细胞分裂素浓度为1．5 mg/L 的 MS 培养基的国庆菊丛生芽增殖倍数最大,达17．5;其次是浓度为0．5 mg/L 的 N6培养基,为11．5;浓度为0．5 mg/L 的 White 培养基的丛生芽增殖倍数最小,仅1．7。MS 是继代增殖培养的最适培养基,1．5 mg/L 是最适细胞分裂素浓度。     

杭白菊引种与品质研究

[目的]研究杭白菊在安徽亳州市、山西芮城县和太谷县的引种表现,以满足引种地对杭白菊的需求,扩大杭白菊的生产区域和栽培面积。[方法]观察和测定杭白菊在3个引种地的物候期、产量性状、生长开花习性和品质。[结果]从5年的引种结果看,芮城和太谷引种2地的杭白菊花芽分化期均比原产地早,如初花期桐乡市为10月25日,而太谷县为10月5日,比原产地早开花20余d;越向北引种越有产量下降和植株增高的趋势,引种2地(芮城、太谷)的产量均比原产地低;初开杭白菊各项指标均比较好,但产量过低,半开花期和盛开花期采收的产量和各指标都符合生产需要,为采收适宜期。[结论]引种地亳州市和芮城县可成为杭白菊新的生产基地;而太谷县在个别年份,开花期遇霜冻,产品变质而不能入药,目前还不是杭白菊的安全生产地,需要继续驯化。     

用于菊花品种核型分析的根尖压片技术研究

根尖压片技术是研究植物中期染色体数目和形态的一种重要方法。以2个大菊品种的根尖为材料,以典型中期分裂相的数目、中期染色体的分散程度、聚缩程度和中期染色体的清晰性为衡量制片效果优劣的标准,通过对比不同预处理药剂、取材时间、预处理温度、预处理时间长短以及解离时间条件下的制片效果,得出如下结论：当根长至1 cm时,在9：00~10：00取根,用饱和对二氯苯溶液在4℃条件下预处理4 h,然后用卡诺固定液固定22~24 h,用1 mol/L的HCl60℃下解离10 min,能够得到数量较多、染色体分散良好、染色体形态清晰以及染色体长度适中的中期分裂相。     

超声波辅助提取亳菊总黄酮的研究

[目的]优化影响超声波辅助乙醇提取亳菊总黄酮的因素,提高黄酮的提取率。[方法]设计单因子试验和L9(34)多因子的正交试验,研究料液比、超声时间、浸提时间及浸提温度4个因素对亳菊总黄酮提取率的影响。[结果]超声波辅助乙醇提取亳菊总黄酮的最佳条件为料液比1∶30 g/ml、超声50 min、80℃浸提80 min,在该条件下亳菊总黄酮提取率为11.32%。[结论]通过优化提取条件提高了亳菊总黄酮的提取率,为亳菊的开发利用奠定了基础。     

亳菊叶片组织培养技术优化的研究

[目的]研究不同植物生长物质对诱导亳菊叶片愈伤组织诱导和不定芽分化的影响。[方法]以亳菊组培苗的叶片作为外植体,使用正接和背接2种方式接种于正交设计的培养基中,诱导叶片形成愈伤组织;再将愈伤组织接种于新配制的培养基中,对愈伤组织诱导率和芽分化率进行方差和极差分析。[结果]诱导亳菊叶片形成愈伤组织最佳的培养基组合为MS＋2.0 mg/L 2,4-D＋2.0 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L NAA;诱导愈伤组织分化成不定芽的最佳培养基是MS＋2.0 mg/L 6-BA＋0.5 mg/LNAA。[结论]为亳菊的遗传转化体系构建和诱变育种提供了高效的操作系统。     

小麦胁迫相关基因TaLEA2的克隆、生物信息学及表达特性分析

【目的】克隆小麦Triticum aestivum晚期胚胎发育丰富蛋白基因并对其进行基因结构、蛋白特性及表达模式分析,为其耐盐性研究奠定理论基础.【方法】搜索小麦EST数据库,通过同源克隆分离并获得小麦晚期胚胎发育丰富蛋白基因,用生物信息学软件分析该基因结构及蛋白特性,荧光定量试验分析该基因的表达模式.【结果和结论】获得1条1 100 bp的核苷酸序列,该序列包含了1个981 bp的开放阅读框,编码1个由326个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白含有2个LEA2结构域,属于第2组LEA蛋白,该蛋白命名为TaLEA2.生物信息学分析显示TaLEA2蛋白具有LEA2家族的典型特征,富含赖氨酸(Lys),不含半光氨酸(Cys),无明显的高级结构,平均亲水系数(GRAVY)为-0.405,稳定系数为25.28,这种氨基酸组成及结构均有利于蛋白的热稳定性及亲水性.实时荧光定量PCR分析表明,TaLEA2基因为组成型表达,同时该基因存在组织表达差异,且表达受不同发育时期影响;该基因调控表达受高盐、低温、病原菌及干旱等胁迫的影响,尤其在干旱胁迫中上调表达明显,但该基因不受外源ABA刺激的影响.推测TaLEA2基因参与了小麦正常条件下的生长发育,同时也广泛地参与了小麦抵御逆境胁迫的响应,尤其在小麦的抗旱胁迫过程中发挥重要作用.     

菊花多糖最佳提取工艺研究

考察了提取温度、提取时间、pH值、液固比、醇沉终浓度等理化因素对菊花多糖提取效果的影响,确定了菊花多糖的最佳提取工艺参数.结果表明,提取温度95℃、提取时间3 h、液固比25∶1、醇沉终浓度为80%,菊花多糖的提取率为18.54%;微波助提可以明显提高菊花多糖的提取效率.