| 沙葱萤叶甲气味结合蛋白GdauOBP20的基因克隆、 原核表达及其结合特性 |
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| 引用本文： | 李玲,谭瑶,周晓榕,庞保平. 沙葱萤叶甲气味结合蛋白GdauOBP20的基因克隆、 原核表达及其结合特性[J]. 中国农业科学, 2019, 52(20): 3705-3712. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.20.020 |
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| 作者姓名： | 李玲 谭瑶 周晓榕 庞保平 |
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| 作者单位： | 内蒙古农业大学草原昆虫研究中心,呼和浩特 010020 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金(31360441) |
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| 摘 要： | 【目的】 沙葱萤叶甲（Galeruca daurica）是近年来在内蒙古草原上暴发成灾的新害虫,本文旨在克隆沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20的cDNA全长序列,明确其重组蛋白与寄主植物挥发物的结合特性,为揭示沙葱萤叶甲嗅觉的分子机理打下基础。【方法】 基于沙葱萤叶甲转录组数据,利用RACE技术对沙葱萤叶甲气味结合蛋白基因GdauOBP20进行cDNA全长克隆;利用生物信息学软件预测分析其编码蛋白的理化特性和结构特征;通过原核表达系统表达目的蛋白,并使用Ni-NTA Agarose亲和层析柱进行重组蛋白纯化。最后采用荧光竞争结合的方法,以N-苯基-1-萘胺（N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN）为荧光探针,检测GdauOBP20重组蛋白与13种主要寄主挥发物的结合情况。【结果】 GdauOBP20的cDNA全长序列为567 bp（GenBank登录号MK250532）,其中5′末端非编码区长24 bp,3′末端非编码区长123 bp,具有ployA尾结构;开放阅读框（ORF）全长为420 bp,编码139个氨基酸。氨基酸序列中含有4个保守的半胱氨酸位点,属于Minus-C OBP亚家族。预测蛋白三级结构中含有6个α螺旋和两对由半胱氨酸形成的二硫键。成功构建了重组表达载体并获得了高纯度的重组蛋白。重组蛋白GdauOBP20与荧光探针1-NPN的结合常数为12.8 μmol·L -1,结合能力较好,可作为本试验的荧光报告子。在所测的13种主要寄主植物挥发物中,除与二烯丙基三硫醚无结合能力外,GdauOBP20重组蛋白与其他12种寄主植物挥发物均有不同程度的结合能力,其中与对二甲苯和环庚三烯的结合能力最强,解离常数分别为22.91和26.55 μmol·L -1,而与月桂烯结合能力最弱,解离常数为116.29 μmol·L -1。【结论】 沙葱萤叶甲GdauOBP20能与寄主植物的多种主要挥发性物质结合,推测其可能在沙葱萤叶甲对寄主植物的定位过程中发挥重要的作用。
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| 关 键 词： | 沙葱萤叶甲 气味结合蛋白 RACE克隆 原核表达 荧光竞争结合试验 |
| 收稿时间： | 2019-03-11 |
Molecular Cloning,Prokaryotic Expression and Binding Characterization of Odorant Binding Protein GdauOBP20 in Galeruca daurica |
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| Ling LI,Yao TAN,XiaoRong ZHOU,BaoPing PANG. Molecular Cloning,Prokaryotic Expression and Binding Characterization of Odorant Binding Protein GdauOBP20 in Galeruca daurica[J]. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(20): 3705-3712. DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.20.020 |
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| Authors: | Ling LI Yao TAN XiaoRong ZHOU BaoPing PANG |
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| Affiliation: | Research Center for Grassland Entomology, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010020 |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Galeruca daurica odorant binding protein RACE cloning prokaryotic expression fluorescence competitive binding assay |
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