鲫鱼肠道对四种蛋白质饲料的体外消化与其酶解液中氨基酸吸收效率的研究

采用离体消化方法测定了鲫鱼肠道对鱼粉、花生粕、菜粕、棉籽粕的体外消化率和氨基酸的生成效率。同时采用同位素示踪法和肠道离体灌流模型分别测定了鲫鱼离体肠道对4种蛋白质饲料体外酶解液中氨基酸的吸收速度。结果表明:鲫鱼肠道对鱼粉、花生粕、菜粕、棉籽粕的体外消化率分别为48.51%、85.52%、60.64%、67.22%,其中以花生粕最高,鱼粉最低,消化率彼此之间的差异均显著(P<0.05)。在酶解过程中氨基酸的生成量逐渐增加,以生成的氨基酸量占饲料量的百分比表示氨基酸的生成效率,在酶解7h时以鱼粉最高为12.23%,其次是花生粕为12.14%、棉籽粕为11.23%、菜粕为6.78%。鲫鱼肠道(每克)对4种蛋白质饲料酶解液中氨基酸的吸收转运速度,以鱼粉最高,在灌流40min时,速度为1.058mg/min,其次为花生粕0.782mg/min、棉籽粕0.679mg/min、最低为菜粕0.451mg/min,差异显著(P<0.05)。如果以单位时间内肠道对氨基酸的吸收转运量占流过肠道的氨基酸总量的比例表示肠道对氨基酸的吸收效率,结果为鲫鱼肠道对4种蛋白质饲料酶解液氨基酸的吸收转运效率间无显著性差异(P>0.05),所以肠道对氨基酸的吸收效率可能并不受饲料种类的影响。量。采用凯氏定氮法对烘干的饲料样品和消化滤渣进行粗蛋白质含量测定,按照公式计算饲料样品的离体消化率:蛋白质离体消化率(%)=(消化前饲料重量×饲料粗蛋白质含量-消化后滤渣质量×滤渣粗蛋白质含量)/(消化前饲料质量×饲料粗蛋白质含量)。1.3酶解液氨基酸总量测定及计算方法按照1.2.2的方法分别对饲料样品进行酶解,于0、1、3、5、7h分别取酶解液0.2ml(同时补充等体积的磷酸缓冲液),加入10%的三氯醋酸0.2ml,待蛋白质沉淀后以6000r/min离心20min后,取上清液0.1ml采用茚三酮法测定OD570值,用亮氨酸作标准曲线计算酶溶液氨基酸的总量,再按照酶解的氨基酸总量(扣除饲料酶解前的游离氨基酸含量)占饲料量的百分比计算氨基酸的消化生成效率。1.4用于肠道灌注的酶解液制备方法按照1.2.2的方法对鱼粉、花生粕、菜粕、棉籽粕进行酶解7h后,取酶解液以10000r/min离心25min,收集上清液为酶解液,于冰箱冷冻保存备用。定量取此酶解液0.2ml加入10%三氯醋酸0.2ml,待蛋白质沉淀后以6000r/min离心20min,采用茚三酮定量测定酶解液氨基酸浓度。1.5灌注试验方法采用叶元土等利用的肠道灌注系统进行蛋白质饲料酶解液的灌注试验。整个灌注系统置于生化培养箱中,控制环境温度在28℃,恒流泵控制灌注液的流量在2.00ml/min,由氧气瓶从灌流开始前5min就向培养液中充入医用氧气以保持肠道组织活性。1.6离体肠道的制备将鲫鱼捣毁脊髓处死,立即解剖取出肠道,在生理盐溶液浸渍下剔除肠道外壁上的脂肪、血污等,在灌流系统中用生理盐溶液冲洗干净肠道内容物,置于生理盐溶液中待用。每次灌注试验用一尾鲫鱼的肠道,每次试验至少重复3遍。用于解剖获取肠道的鲫鱼平均体重为126g,试验前养殖于室内循环养殖系统中,养殖环境温度为25℃左右,投喂粗蛋白质为30%的颗粒配合饲料2周以上。1.7肠道对氨基酸平均转运速度计算方法在灌注液中加入放射性酪氨酸(L-4,5-3H]-tyr,放射性浓度为0.5毫居里/毫升),从灌注开始(0min)每10min取肠道外培养液0.1ml,持续40min,并取开始时肠道外培养液样品。每次取样品液100μl,取3个平行样品,并补充同样体积的生理盐溶液以保持肠道外培养液总体积恒定。取肠道内灌流液100μl于闪烁瓶内,设3个平行样品,样品液均置于闪烁瓶内,加入闪烁液5ml放置半小时后,在SN-6930液体闪烁计数器中计数(cpm值)。因灌流液的氨基酸浓度是已测知的,所以根据灌流液cpm值和肠道外培养液cpm值,就可计算出肠道外培养液的氨基酸浓度,再根据培养液体积(40ml)计算经过肠道转运到培养液中的氨基酸总量,最后根据吸收转运的时间计算单位质量肠道对氨基酸的平均转运速度。1.8数据的表示与处理由于鱼体大小差异使肠道长度和质量有一定的差异,为减小试验误差,统一比较标准,我们把鲫鱼肠道对试验氨基酸的跨壁运输量表示为单位肠道组织重量(g)对试验氨基酸的跨壁运输量,并以此为基础计算氨基酸吸收转运速度,计算公式如下:转运到肠道外培养液中氨基酸的浓度=灌流液氨基酸浓度×(肠道外培养液cpm值-空白培养液cpm值)/灌流液cpm值;跨壁运输量=(培养液cpm值-空白培养液cpm值)×灌流试验氨基酸浓度×培养液体积/(灌流液cpm值×肠道质量);氨基酸平均转运速度=(培养液cpm值-前10min时培养液cpm值)×灌流试验氨基酸浓度×培养液体积/(灌流液cpm值×肠道质量×10)。在肠道灌注系统中用恒流泵控制肠道酶解液的流过速度为2.00ml/min,通过酶解液中氨基酸的浓度计算单位时间(min)流过肠道的氨基酸量。肠道对氨基酸的吸收转运效率(%)=每分钟氨基酸的平均吸收转运量/每分钟流过肠道内的氨基酸量。数据采用Microsoft-Excel2003作统计处理,采用多重比较的最小显著极差法(LSR法)进行差异显著性分析。2试验结果2.1离体消化率鱼粉、花生粕、菜粕、棉籽粕4种蛋白质饲料在消化前的粗蛋白质含量分别为69.13%、55.06%、44.25%、50.58%。在离体条件下,通过肠道消化酶水解7h,得到鲫鱼对鱼粉、花生粕、菜粕、棉籽粕蛋白质的离体消化率分别为48.51%、85.52%、60.64%、67.22%,花生粕消化率最高,鱼粉最低,消化率彼此之间的差异均显著(P<0.05)。2.2酶解蛋白质饲料氨基酸生成效率

Effect of crucian intestines on digestion of four kinds of protein in vitro and its amino acid absorbtion efficiency