从江香猪PHKG2基因超表达载体和RNA干扰载体的构建及其表达

旨在克隆从江香猪磷酸化酶激酶γ2(phosphorylase kinase gamma 2,PHKG2)基因编码区,并对PHKG2基因功能进行初步探究。本研究利用RT-PCR法扩增从江香猪PHKG2基因完整CDS区。通过构建pEGFP-N3-PHKG2超表达载体,设计并合成4对针对从江香猪PHKG2基因的RNAi表达载体,瞬时转染至C2C12细胞株和从江香猪肾细胞中,以正常生长的细胞为空白对照,24h后检测各个重组载体的绿色荧光蛋白的表达情况。48h后提取细胞总RNA,利用qRT-PCR方法检测目的基因PHKG2和糖原代谢相关基因糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase,muscle form,PYGM)、肌肉糖原合成酶(glycogen synthase 1(muscle),GYS1)、磷酸甘油酸变位酶(Phosphoglyce rate mutase,PGAM2)基因mRNA的表达情况,并且测定各组细胞中的糖原含量。结果表明,经过双酶切、测序检测以及脂质体瞬时转染至C2C12细胞中,验证超表达载体pEGFP-N3-PHKG2和4对RNAi表达载体均构建成功。转染至从江香猪肾细胞后,相对于空白对照(Blank)和阴性对照(pEGFP-N3),超表达载体pEGFP-N3-PHKG2能极显著提高PHKG2基因的表达量(P0.01),同时显著上调PGAM2、PYGM基因的表达量(P0.05),并且显著降低细胞中糖原的含量(P0.05)。各RNAi载体中,相对于空白对照(Blank)和阴性对照(NC),shRNA-1的干扰效率较高,极显著下调PHKG2基因的表达量(P0.01),显著下调PGAM2、PYGM、GYS1基因的表达量(P0.05),并且显著升高细胞中糖原含量(P0.05)。shRNA-2极显著下调PHKG2基因的表达量(P0.01);shRNA-3对PHKG2基因的表达也能起到显著的干扰作用(P0.05);shRNA-4对于所检测的4个基因干扰效果不明显;shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4转染细胞后,细胞中糖原含量升高水平不明显。PHKG2基因超表达和RNAi后可分别明显上调和抑制PHKG2、PYGM、PGAM2、GYS1基因的表达,并且分别降低和提高糖原含量,可能是影响从江香猪猪肉品质的重要候选基因,为进一步研究PHKG2基因在细胞糖原代谢通路中的作用机制奠定基础。