小反刍兽疫病毒原核表达体外转录系统的建立 |
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引用本文: | 高华峰,赵文华,高林,杨仕标.小反刍兽疫病毒原核表达体外转录系统的建立[J].动物医学进展,2016(10):21-25. |
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作者姓名: | 高华峰 赵文华 高林 杨仕标 |
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作者单位: | 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室,云南昆明,650024 |
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基金项目: | 国家自然科学基金项目(31160499) |
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摘 要: | 构建了小反刍兽疫病毒(PPRV)辅助质粒和微型复制子(minireplicon)并进行功能学研究。RT-PCR克隆PPRV疫苗株N75/1N、P和L基因,亚克隆至有T7启动子的原核表达载体pGEM3Z构建完成3个辅助质粒,分别命名为pGEM3Z-N、pGEM3Z-P和pGEM3Z-L,并通过全基因合成构建含PPRV病毒5′端启动子序列(AGP)、3′端启动子序列(GP)、T7转录终止信号、丁型肝炎病毒核酶序列HamRZ及氯霉素乙酰转移酶(CAT),获得PPRV微型复制子重组质粒pGEM3Z-CAT。构建完成的微型复制子及辅助质粒在表达T7RNA多聚酶(T7RNP)感染痘病毒VTF7-3后,通过脂质体法优化4种质粒配比,并将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光分析CAT的表达情况,荧光显微镜观察到荧光的表达,并通过免疫印迹分析CAT蛋白的表达,表明构建的PPRV微型复制子具有转录和复制功能,这将有助于进一步开展以PPRV反向遗传操作为基础的免疫学及蛋白功能研究。
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关 键 词: | 小反刍兽疫病毒 微型复制子 氯霉素乙酰转移酶 |
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