半滑舌鳎vasa调控区的克隆、表达载体构建及其驱动活性检测

为研究半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)vasa(Csvasa)基因调控区的功能,在已克隆的Csvasa基因编码序列的基础上,采用基因组步移和PCR扩增的方法克隆得到Csvasa调控区,通过生物信息学方法分析vasa基因5′区,并构建了含Csvasa基因调控区的绿色荧光蛋白(GFP)表达载体(p Csvasa-GFP-T),进一步通过显微注射技术初步验证调控区的驱动活性。结果表明,通过基因组步移和PCR扩增获得Csvasa 5′区5 166 bp和3′区1 655 bp,利用在线生物信息学软件对5′区序列进行分析,发现在转录起始点上游26 bp处存在保守的TATA框,以及潜在的转录因子结合点如SRY、Oct-1、Sox-5、CREB、GATA、AP-1、C/EBP、Sp-1、c-Myc、HNF、NKX2-5、V-Myb等。通过显微注射技术,将所构建的p Csvasa-GFP-T表达载体注射于青鳉(Oryzias latipes)受精卵并进行培养观测,发现Csvasa调控区能够驱动GFP在青鳉胚胎内表达,荧光表达率为81%。将有荧光的胚胎培养为成鱼,检测外源基因的整合率为11.5%。这些结果为进一步研究半滑舌鳎原始生殖细胞(PGCs)的标记、追踪和操作研究以及半滑舌鳎的性别控制等奠定了基础。