| 一种大规模制备双链RNA的简单方法及其在斑节对虾中的应用 |
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| 引用本文： | 梁艳,Vanvimon Saksamerprome,Kallaya Sritunyalucksan,黄倢.一种大规模制备双链RNA的简单方法及其在斑节对虾中的应用[J].水产学报,2010,34(7):1011-1017. |
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| 作者姓名： | 梁艳 Vanvimon Saksamerprome Kallaya Sritunyalucksan 黄倢 |
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| 作者单位： | 1. 中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室,山东 青岛 266071
2. Center of Excellence for Shrimp Molecular Biology and Biotechnology,Faculty of Science,Mahidol University,泰国 曼谷 10400;National Center for Genetic Engineering and Biotechnology(BIOTEC),National Science and Technology Development Agency(NSTDA),泰国 曼谷,12120 |
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| 基金项目： | 国家“九七三”项目(2006CB101801); 国家“八六三”高技术研究发展计划(2006AA100312); 泰国BIOTEC; 基本科研业务费专项经费(2060302/2) |
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| 摘 要： | RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)诱发的特异性沉默目的基因表达的过程,一种大规模制备双链RNA的方法可以便利RNAi技术的应用。以斑节对虾kazal型蛋白激酶抑制剂(KPI)基因为例,详细介绍了一种以体内载体表达大量制备dsRNA(>300nt)的方法。使用商业载体pGEMT和pDRIVE,以2步克隆法构建含有发夹环(hairpin loop)dsRNA表达载体,转化RNA酶Ⅲ缺陷的大肠杆菌HT115(DE3)进行体内转录制备dsRNA。构建的发夹RNA表达载体含有494bp的正向靶序列和403bp的反向互补靶序列,其中正向靶序列多出的91bp即可成为loop环,而无需再次克隆加入。培养30mL的细菌,即可得到1mg纯化的dsRNA,而其成本仅为使用商业化体外转录试剂盒的四分之一。为评估RNAi效果,按照每1克虾体肌肉注射2μg dsRNA的剂量,在dsRNA注射后0,6,12和24h采集血淋巴,RT-PCR检测KPI mRNA的基因转录水平。与对照组GFP-dsRNA和NaCl注射组相比,KPI-dsRNA注射组可以在24h内沉默血淋巴中的KPI基因。结果表明该方法是可大规模制备长的dsRN...
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| 关 键 词： | 斑节对虾 RNA干扰 双链RNA 体内转录 大肠杆菌HT115 kazal型蛋白激酶抑制剂 |
| 收稿时间： | 2/5/2010 12:00:00 AM |
| 修稿时间： | 4/7/2010 12:00:00 AM |
Synthesis double stranded RNA on a large scale and its application in Penaeus monodon |
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| LIANG Yan,Vanvimon Saksamerprome,Kallaya Sritunyalucksan,HUANG Jie.Synthesis double stranded RNA on a large scale and its application in Penaeus monodon[J].Journal of Fisheries of China,2010,34(7):1011-1017. |
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| Authors: | LIANG Yan Vanvimon Saksamerprome Kallaya Sritunyalucksan HUANG Jie |
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| Institution: | LIANG Yan1,Vanvimon Saksamerprome2,3,Kallaya Sritunyalucksan2,HUANG Jie1(1.Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Key Lab of Sustainable Utilization of Marine Fishery Resource,Ministry of Agriculture,Qingdao 266071,China,2.Center of Excellence for Shrimp Molecular Biology and Biotechnology,Faculty of Science,Mahidol University,Rama VI Rd,Bangkok 10400,Thailand,3.National Center for Genetic Engineering and Biotechnology(BIOTEC),National Science and Technology Develop... |
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| Abstract: | RNA interference(RNAi)is initiated by double-stranded RNA(dsRNA)and has been used to improve our knowledge of the shrimp immune system.RNAi has also been used on a therapeutic approach for shrimp virus control.Method for dsRNA synthesis on a large scale will facilitate the application of RNAi in farmed shrimp.Kazal proteinase inhibitor(KPI) gene of shrimp Penaeus monodon was used as an example to show a large-scale preparation of long double-stranded RNA(>300 nt) in detail by a 2-step cloning method.Two com... |
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