羊绒细度候选基因靶标miRNAs筛选和鉴定

为筛选和验证辽宁绒山羊粗型和细型个体羊绒细度相关候选基因ALX4、NT-3、POLD2和AKT1表达调控潜在靶标miRNAs及其表达差异,提取辽宁绒山羊细型和粗型皮肤组织DNA和RNA,先采集辽宁绒山羊粗型和细型肩胛部皮肤组织,根据NCBI上的序列克隆获得ALX4、NT-3、POLD2和AKT1基因的3'UTR,利用Primer 5.0设计并合成功能引物,通过常规PCR扩增ALX4、NT-3、POLD2和AKT1基因的3'UTR序列,在miRBase数据库中,筛选羊绒细度候选靶基因3'UTR靶标miRNAs,然后与辽宁绒山羊(LCG)和内蒙古绒山羊(MCG)品种间皮肤miRNAs高通量测序结果共聚焦,筛选和验证羊绒细度相关候选基因表达调控潜在靶标miRNAs,在NCBI中检索到miRNAs的前体序列,应用RNAfold获得二级结构图及势能图,通过qPCR验证细型辽宁绒山羊(Fine type LCG)和粗型辽宁绒山羊(Coarse type LCG)皮肤组织中羊绒细度候选基因ALX4、NT-3、POLD2和AKT1靶标miRNAs的表达量。结果表明:通过miRBase数据库预测,羊绒细度候选基因ALX4、NT-3、POLD2和AKT1分别获得104,27,19和32个靶标miRNAs,与绒山羊品种间皮肤miRNAs高通量测序结果聚焦分析,ALX4基因聚焦到3个靶标miR-m13,miR-433-5p和miR-671,其表达量是56,2和27;NT-3基因聚焦到1个靶标miR-1296,表达量是41;POLD2基因聚焦到1个靶标miR-130b,表达量是177;AKT1基因聚焦到2个靶标miR-345-3p和miR-2331-3p,其表达量是52和5。其中前体序列的二级结构表明miR-2331-3p的结构最不稳定,miR-1296最小自由能的绝对值最大,结构最为稳定。用qPCR验证miR-m13,miR-433-5p,miR-671,miR-1296,miR-345-3p和miR-2331-3p在辽宁绒山羊细型皮肤中的表达量都显著高于粗型皮肤中的表达量,可能对羊绒细度候选基因发挥重要的正调控作用,而miR-130b在LCG粗型的表达量高于LCG细型表达量,可能miR-130b对羊绒细度相关候选基因起负调控作用。