大熊猫轮状病毒可视化LAMP检测技术的建立及应用

根据大熊猫轮状病毒CH–1株VP4基因设计3对引物，建立大熊猫轮状病毒可视化环介导等温扩增(LAMP)检测技术，对其反应条件进行优化及特异性和灵敏度进行验证。结果表明：用可视化LAMP方法检测大熊猫轮状病毒时，在62 ℃条件下，反应体系中加入终浓度为8 mmol/L Mg2+、0.6 mol/L甜菜碱、12 U Bst DNA聚合酶和1×LAMP可见光染料，扩增40 min后，阳性样本颜色由紫色变为蓝色，电泳分析扩增产物可观察到明显的梯状条带；用建立的LAMP方法对大熊猫轮状病毒进行扩增，特异性好；其批内及批间的变异系数均小于1%，重复性好；其最低检测限为5×10–5 ng/μL RNA，灵敏度比常规PCR高约100倍；采用该方法检测50份大熊猫粪便样的轮状病毒，共检测到阳性样本22份，比常规PCR方法检测到的阳性样本多5份，与荧光定量PCR方法的吻合度为100%。可见，用LAMP方法检测大熊猫轮状病毒具有操作简便、反应时间短、特异性强、结果判定快速等特点，可用于临床上大熊猫轮状病毒的快速检测。