| 摘 要： | 【目的】为了探索秦川牛(Bos taurus)SMAD1基因在成肌细胞分化过程中的分子作用机制,通过研究沉默、过表达该基因后对牛原代成肌细胞分化及成肌相关基因表达量的影响,以期为BMP信号通路在牛肌肉组织生长发育过程中的作用机制提供理论依据。【方法】根据Genbank牛SMAD1(NM_001077107.2)已知序列设计并合成靶向沉默SMAD1基因的干扰序列si SMAD1和阴性对照siRNA-NC。以秦川牛原代成肌细胞cDNA为模板,利用PCR技术克隆获得SMAD1基因CDS序列,构建腺病毒过表达穿梭载体pDC316-mCMV-EGFP-b SMAD1。将腺病毒基因组质粒和腺病毒载体穿梭质粒共转染到HEK 293细胞中,通过Cre-loxp重组酶获得重组腺病毒。获得的携带目的基因的腺病毒标记为AD-b SMAD1,重组质粒pDC316-EGFP标记为AD-NC,用做对照组病毒,利用LaSRT法测定腺病毒的滴度。将获得的干扰序列si SMAD1和过表达腺病毒AD-b SMAD1分别侵染秦川牛原代成肌细胞,采用实时荧光定量PCR检测SMAD1基因和成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的mRNA水平,并观察对细胞分化融合情况的影响。【结果】成功获得了1条能有效沉默SMAD1基因siRNA,将其转染秦川牛原代成肌细胞后进行人工诱导分化,相比对照组,SMAD1基因分别下调了75.4%(诱导1d,P0.01)、66.7%(诱导3d,P0.01)、60.0%(诱导6d,P0.01)、54.7%(诱导9d,P0.01)。此外,还成功构建了秦川牛SMAD1基因的腺病毒过表达穿梭载体,获得了滴度为1×10~(10)pfu/mL的过表达重组腺病毒AD-b SMAD1。与对照组相比,高滴度过表达病毒AD-b SMAD1侵染秦川牛原代成肌细胞0、1、3、6、9d后,与对照组相比,SMAD1基因的表达水平分别上调了2.10倍(诱导1d)、3.19倍(诱导3d)、105.3倍(诱导3d),P0.01)和144倍(诱导9d,P0.01);结合肌管形成过程的变化和实时荧光定量结果证明,SMAD1基因促进原代成肌细胞分化和肌管形成,并显著上调成肌标志基因MyoD、Myf5、MyoG的表达。【结论】获得了能有效沉默秦川牛原代成肌细胞SMAD1表达的特异性的干扰序列si SMAD1,以及可成功实现过表达SMAD1基因的腺病毒介导的体外表达载体,可正向调控成肌细胞的分化和肌管形成过程。
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