| 摘 要： | 【目的】目前基于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)spCas9为核心的CRISPR/Cas9基因编辑系统在乳酸菌上的应用受到很多限制,亟待开发适合于乳酸菌的基因编辑系统。对6株干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的CRISPR系统进行深入分析,并预测激活干酪乳杆菌自身Cas9蛋白所识别的PAM序列,为开发适用于乳酸菌的CRISPR/lcCas9基因编辑系统奠定基础。【方法】以已完成全基因组测序的6株干酪乳杆菌为研究对象,利用生物信息学方法对其CRISPR系统进行深入分析,重点对不同菌株的CRISPR系统结构进行解析,并且对Cas蛋白以及spacer的同源性进行分析,最后对CRISPR区重复序列的二级结构以及Cas9蛋白识别的PAM序列进行预测。【结果】6株干酪乳杆菌CRISPR系统具有相似的结构,均具有特征性的Cas9蛋白,并且Cas基因序列保守。预测到tracrRNA位于Cas9和Cas1之间,重复序列可以形成茎部长达7个碱基的二级结构。根据CRISPR的间隔区序列,6株干酪乳杆菌可被分为3个基因型,将间隔区逐一进行blast比对,结果表明6个间隔区比对上14个来源不同的原间隔序列,这些间隔序列均来源于不同质粒。干酪乳杆菌lcCas9蛋白识别PAM序列的1、3位碱基偏好T/C、A/C,2、4位碱基对G、A的偏好性比较大。【结论】6株干酪乳杆菌CRISPR系统均为type-ⅡA型,Cas序列和重复序列高度保守。DR序列可以形成稳定的二级结构,TGMA为干酪乳杆菌Cas9蛋白高效识别的PAM序列。
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