| 摘 要： | 【目的】建立牛肉及中式加工品中猪肉成分的定性、定量检测方法,保障牛肉产品的纯正性。【方法】提取猪肉及不同加工猪肉制品中的猪基因组DNA,通过DNA质量检测,PCR扩增,灵敏度试验,分析加工方式对猪DNA质量、灵敏度和检测限的影响;制备生牛肉和经干、蒸、煮、炖、煎、炸、烤制处理的牛肉制品中掺入不同比例(10%、5%、1%、0.1%)猪肉的二元混合肉,进行普通PCR和荧光定量PCR定性定量检测,探索DNA在掺假鉴别中的应用。【结果】不同加工方式下猪DNA质量检测结果显示,不同加工方式显著影响DNA纯度(P0.05),生猪肉及7种猪肉制品中DNA纯度(A260nm/A280nm)范围为1.893—1.977,高于理论值1.8;DNA含量范围为110—277μg·g-1,经加工处理的猪肉制品的DNA含量显著高于生猪肉处理组(P0.05);琼脂糖电泳结果发现,放置6个月后生猪肉和7种肉制品的DNA严重降解,但生猪肉依然能获得一些不清晰的长片段DNA,而7种肉制品的猪DNA全部降解为小片段DNA,说明长时间放置和热处理明显影响了猪DNA的完整性;猪肉制品中DNA的降解虽然严重,经普通PCR扩增线粒体基因,所有样品的PCR产物均呈现为清晰且单一的条带,可见从加工肉制品中提取的DNA可以开展灵敏度试验和掺假检测试验;灵敏度试验结果显示普通PCR是高度敏感的,经10倍梯度稀释,8个试验组样品中提取的猪DNA最低检测限均为0.005 ng;荧光定量PCR扩增猪DNA所得Ct值形成的标准曲线也具有良好的线性关系,其标准曲线斜率处在-3.1—-3.7,决定系数R2值均大于0.99,PCR扩增效率处在89%—100%,且定量PCR最低能够检测出0.005 ng的猪DNA。掺假样品定性定量PCR检测结果显示,除炸制混合肉(为1%)外,混合生肉及其他6种混合肉制品的定性检测试验最低检测限均为0.1%,说明普通PCR可检测微量的猪肉成分;混合肉的定量试验中根据不同掺假比例所建立的8个试验组标准曲线的决定系数R20.99,斜率为-3.1—-3.6,各曲线均具有良好的线性关系,可以实现牛肉中猪肉成分的定量检测;对比生肉与肉制品的定量结果,混合生肉与混合肉制品的标准曲线的截距之间存在约0.01—0.6个循环数的差异。【结论】不同加工处理能够显著影响肉中DNA的含量、纯度和完整性,但不影响肉制品中DNA的检测限和灵敏度,普通PCR和定量PCR均可以检测到极微含量的掺假肉成分。可见,基于PCR技术的检测方法灵敏度高、速度快、特异性强,定量检测标准曲线有较高的线性相关性和扩增效率,可为肉类行业质量控制和检验计划以及验证标签声明提供可靠的依据,可应用于一些商业样品,以保证肉制品的纯正性。
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