环形泰勒虫感染细胞抑制性消减文库的构建及ESTs分析

【目的】环形泰勒虫（Theileria annulata）可以感染牛B淋巴细胞、树突状细胞和巨噬细胞，并可使被感染细胞发生转化，体外培养时可获得类似肿瘤样细胞的无限增殖能力。本研究通过构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库，筛选环形泰勒虫裂殖体基因及转化细胞与宿主正常细胞之间的差异表达基因。【方法】以环形泰勒虫裂殖体转化细胞和非感染牛外周血单个核细胞（即非转化宿主细胞）为试验材料，提取总RNA和mRNA，反转录合成cDNA；然后分别作为tester和driver，进行抑制性消减杂交（SSH），构建环形泰勒虫转化和非转化宿主细胞抑制性消减文库；对随机挑取的阳性克隆进行测序及生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR对文库部分差异基因进行验证。【结果】通过对文库454个阳性克隆进行测序，共获得了有效表达序列标签（ESTs）364条，大小主要分布在350-1 200 bp之间；将这些ESTs序列在GenBank中进行BLASTn网上序列比对，其匹配于192条基因序列；其中包括环形泰勒虫序列60条(11条为虫体蛋白酶基因序列、10条为膜蛋白基因序列、7条为假设蛋白基因序列、5条为凋亡相关虫体蛋白基因序列、5条为核糖体蛋白基因序列、4条为细胞周期蛋白基因序列、4条为虫体抗原基因序列和虫体其它基因序列14条)、牛基因序列131条（其中19条为肿瘤相关蛋白基因序列）和1条未知序列；其中已有功能注释的ESTs 285条，再将已知功能的ESTs通过WEGO软件从生物学过程（biological process）、细胞组成（cellular component）和分子功能（molecular function）3个部分进行GO聚类分析，结果表明，宿主细胞差异基因主要集中在细胞、细胞进程、结合、催化、代谢进程、生物调节等功能方面。另外，通过对部分环形泰勒虫裂殖体转化宿主细胞差异基因进行荧光定量PCR分析，结果表明，肿瘤相关基因HCLS1和SENP5在转化宿主细胞中转录水平分别是非感染牛PBMCs(非转化宿主细胞)的2.06和1.32倍。【结论】利用SSH技术，成功构建了环形泰勒虫感染宿主细胞的抑制性消减文库，筛选获得了转化宿主细胞和环形泰勒虫裂殖体的表达基因，并通过荧光定量PCR分析获得了2个可能参与宿主细胞转化的基因，为进步探索环形泰勒虫与宿主细胞相互作用的分子机制奠定了基础。

Construction and ESTs Analysis of SSH Library from Host Cells Infected by Theileria annulata