禽U6启动子的克隆、序列分析及其驱动的siRNA表达 |
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引用本文: | 王永娟,沈鹏鹏,张鑫宇,夏晓莉,孙怀昌.禽U6启动子的克隆、序列分析及其驱动的siRNA表达[J].中国农业科学,2009,42(8):3003-3008. |
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作者姓名: | 王永娟 沈鹏鹏 张鑫宇 夏晓莉 孙怀昌 |
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作者单位: | 1. 扬州大学兽医学院,江苏扬州,225009;江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏泰州,225300 2. 扬州大学兽医学院,江苏扬州,225009 |
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摘 要: | 【目的】分离用于禽源细胞中表达短干扰RNA(short interference RNA,siRNA)的禽U6启动子。【方法】以鸡基因组为模板进行PCR扩增,将扩增产物进行序列测定和生物信息学分析,并将其插入报告基因载体pEGFP-N1中,获得siRNA表达载体pGFP-U6,将由软件预测针对GFP基因的siRNA所对应的shRNA(short hairpin RNA)插入其中,获得pGFP-U6-shRNA;以含人H1启动子的siRNA表达载体pGFP-H1-shRNA为对照,分别转染COS-1和DF-1细胞,用荧光显微镜和流式细胞仪测定转染细胞培养中GFP阳性细胞数和荧光总量。【结果】克隆的U6启动子位于鸡28号染色体,与发表的鸡U6-3启动子同源性为97.2%,含多个Oct-1序列,不含CACCC框、SPH和PSE等聚合酶Ⅲ启动子序列,TA框不典型;在pGFP-U6-shRNA转染的哺乳动物源COS-1细胞培养中,GFP阳性细胞数和荧光总量均有所下降,但不如pGFP-H1-shRNA转染细胞显著;在pGFP-U6-shRNA转染的禽源DF-1细胞培养中,不仅GFP阳性细胞数和荧光总量显著下降,而且基因沉默效果显著优于pGFP-H1-shRNA转染细胞。【结论】成功克隆的禽U6启动子不仅能有效转录siRNA,而且转录活性具有相对的细胞种属特异性。
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关 键 词: | 禽U6启动子 克隆 序列分析 转录活性 |
收稿时间: | 2008-06-25; |
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