基于粗提物的水稻条纹病毒体外“抓帽”体系

【背景】 布尼亚病毒目（Bunyavirales）和正黏病毒科（Orthomyxoviridae）病毒从帽子结构下游10—20个碱基处切割寄主mRNA,以5′端切割产物（帽子序列）作为引物起始自身基因组的转录,生成含一段异源帽子序列的病毒mRNA,这一过程称为“抓帽”。水稻条纹病毒（rice stripe tenuivirus, RSV）是一种布尼亚病毒,其“抓帽”机制还不甚清楚。【目的】 研究RSV粗提物能否从溶液中的外源mRNA“抓帽”,以建立一种便捷的体外体系,用于解析RSV“抓帽”和转录机制。【方法】 以PEG沉淀和超速离心法粗提RSV,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和质谱技术分析粗提物成分。然后取少量粗提液,加入富含珠蛋白（globin）mRNA的兔网织红细胞裂解液（rabbit reticulocyte lysate,RCL）和合适浓度的金属离子配制体外“抓帽”体系。待体外反应结束,提取体系中总RNA,以巢式RT-PCR扩增含珠蛋白-α mRNA帽子序列的RSV mRNA,并对其进行克隆,通过序列分析比较RSV体外“抓帽”与体内“抓帽”的异同。【结果】从100 g感染RSV的水稻叶片获得RSV粗提液2 mL。除RSV病毒粒子外,粗提液中还含核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶等多种叶绿体蛋白。取2 μL粗提液,加入4 mmol·L^-1 MgCl₂、2 mmol·L^-1 NTP、0.8 U·μL^-1 RNA酶抑制剂和8 μL RCL,配成20 μL反应体系,30℃孵育1.5 h后,巢式RT-PCR扩增到了目的条带,表明RSV粗提物能切割溶液中的珠蛋白-α mRNA,并利用其帽子序列合成自身mRNA。在反应体系中加入帽子结构类似物m⁷G（5′）ppp（5′）G后进行相同反应,目的条带变淡,且变淡程度与所加入m⁷G（5′）ppp（5′）G的浓度成正比,表明识别帽子结构是RSV从溶液中切割利用珠蛋白-α mRNA的前提。对巢式RT-PCR产物克隆和测序后分析发现,与在体内的情况类似,RSV从帽子结构下游的A或C处切割珠蛋白-α mRNA,得到的帽子序列与病毒模板链3′端的U或G配对后引发转录。在利用珠蛋白-α mRNA帽子序列进行转录的过程中,RSV频繁使用引发与重配,且在合成核蛋白基因NP时比在合成主要非核蛋白基因NCP时使用该机制的频率更高。【结论】 RSV粗提物能从溶液中的mRNA“抓帽”,且在切取和利用帽子序列的方式上,其表现与细胞内的RSV无明显差别。因而,粗提物可以用来解析RSV的“抓帽”机制,甚至用于研究RSV的转录。

An in vitro Cap-Snatching System of Rice Stripe Tenuivirus Based on Crude Virion Preparations