小麦叶锈菌效应蛋白Pt18906激发TcLr27+31的双层防御反应

【目的】由小麦叶锈菌（Puccinia triticina）引起的小麦叶锈病是影响小麦生产的主要病害之一,在小麦与叶锈菌互作的过程中病菌向寄主细胞分泌效应蛋白,以调控寄主防御反应、发挥毒性功能。开展对小麦叶锈菌效应蛋白的研究,探索小麦叶锈菌的致病机制,为病害的持续防控提供依据。【方法】以小麦叶锈菌13-5-72与感病品种Thatcher互作的cDNA为模板扩增效应蛋白Pt18906,通过SignalP 4.1、TargetP 1.1、TMHMM 2.0和EffectorP 2.0软件对Pt18906进行序列特征分析,利用在线软件Swiss-Model预测Pt18906的三级结构,利用在线软件SOPMA预测Pt18906的二级结构。采用实时荧光定量PCR对Pt18906的表达模式进行分析,借助于烟草的异源表达系统对Pt18906进行抑制Bax和INF1诱导的细胞程序性死亡（programmed cell death, PCD）能力验证,利用酵母系统验证Pt18906的信号肽是否具有分泌功能,采用氨基酸逐步缺失的方法缺失突变Pt18906,从而确定其功能毒性motif;通过在烟草中瞬时表达Pt18906-GFP融合蛋白,结合质壁分离技术分析Pt18906的亚细胞定位,得出效应蛋白的作用位点;利用瞬时表达技术在以Thatcher为背景的不含抗病基因和含有不同抗病基因的全套近等基因系上开展Pt18906无毒性功能分析;采用细菌三型分泌系统（Type Ⅲ secretion system）介导的瞬时转化分析Pt18906对寄主防御反应的调控。【结果】从小麦叶锈菌13-5-72与感病品种Thatcher互作6 d的转录组文库中获得一个在接种24 h后显著高表达的、基因全长序列672 bp、编码223个氨基酸的候选效应蛋白Pt18906,该效应蛋白缺乏已知的功能结构域和保守基序,工作环境偏碱性,在烟草细胞中瞬时表达Pt18906,Pt18906能够抑制Bax和INF1诱导的细胞程序性死亡,表明该效应蛋白具有毒性功能,并且通过构建缺失突变体明确其28—47位氨基酸对其毒性功能具有重要作用,该效应蛋白定位于细胞核和细胞质,表明其作用于细胞内。Pt18906在单基因系抗病品种TcLr27+31和TcLr42上能够引起过敏性坏死反应,表明该效应蛋白的无毒性,Pt18906能够引起TcLr27+31中胼胝质的积累和活性氧的迸发,胼胝质随注射时间的增加而逐渐积累,活性氧在注射后的10 min达到最高。【结论】位于28—47位的氨基酸决定Pt18906的毒性主要功能,Pt18906能激发小麦TcLr27+31双层防御反应。

Puccinia triticina Effector Protein Pt18906 Triggered Two-Layer Defense Reaction in TcLr27+31