小鼠胚胎诱导型Hsp70基因的RNA干扰有效序列筛选

 【目的】应用RNA干扰技术沉默小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblast，MEF）中诱导型热休克蛋白70（Hsp72）基因的表达，从而筛选出对Hsp72基因具有确实干扰作用的siRNA。【方法】设计并合成4对特异性针对Hsp72基因的siRNA，借助LipofectamineTM 2000瞬时转染MEF，41℃热应激处理后，采用RT-PCR和Western blot检测Hsp70 mRNA和Hsp70蛋白表达量。【结果】在热应激组中，siRNA1、siRNA2两组及阳性、阴性和空白3个对照组的Hsp70 mRNA和Hsp70蛋白表达量均极显著高于常温对照组（P＜0.01），siRNA3和siRNA4两组的Hsp70 mRNA的表达量极显著低于常温对照组（P＜0.01）；siRNA3组Hsp70蛋白表达量极显著低于常温对照组（P＜0.01），而siRNA 4组与常温对照组差异不显著（P＞0.05）。与空白对照相比，4对siRNA中siRNA3和siRNA4对MEF中Hsp72 mRNA有极显著（P＜0.01）的抑制作用，其对Hsp72 mRNA的抑制率分别为86.2%和75.4%（P＜0.01），对Hsp72蛋白表达的抑制率分别为77.3%和57.0%（P＜0.01）。【结论】体外合成的四对特异性针对Hsp72基因的siRNA中，靶位点在Hsp72 mRNA二级结构表面位置的siRNA3和siRNA4对Hsp72基因具有显著的抑制作用，靶位点在Hsp72 mRNA二级结构复杂处的siRNA1和siRNA2对Hsp72基因的抑制作用不明显。

Ascertainment of Effective RNAi Sequences of Mouse Embryonic Induced Heat Shock Protein70