基于基因组改组技术的角蛋白酶高产菌株选育研究

【目的】筛选具有高效角蛋白水解活性的微生物,为提高废弃羽毛中角蛋白资源的利用奠定基础。【方法】采用梯度稀释法,以羽毛作为惟一碳氮源对土样中的产角蛋白酶菌株进行筛选,筛选可高效降解羽毛的细菌。通过菌株的形态、生理生化特性以及16S rDNA序列分析,对菌株进行分类鉴定,并探讨其最适发酵条件。利用硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)对目的菌株进行诱变,确定最适诱变条件,并进行原生质体融合,通过基因组改组选育角蛋白酶高产菌株。【结果】分离筛选到1株具有较强羽毛降解能力的菌株ZJT01,该菌落圆形凸出,革兰氏染色呈阳性,酪素水解、硝酸盐利用、柠檬酸利用等生理生化试验均呈阳性。结合菌株16S rDNA同源序列比对分析,初步鉴定其为节杆菌(Arthrobactersp.)。菌株ZJT01产角蛋白酶的最适发酵温度和时间分别为32℃和72h。其DES最适用量为9μL/mL,诱变时间为20min;NTG的最适合质量浓度是0.6mg/mL,处理时间为15min。原生质体制备的最佳条件为:溶菌酶终质量浓度10 mg/mL,酶解温度37℃,酶解0.5h。经过硫酸二乙酯(DES)和亚硝基胍(NTG)分别诱变处理,获得角蛋白酶活性提高的菌株DES-2和NTG-2;对其进行3轮基因组改组后,筛选到2株角蛋白酶活性比亲本菌株ZJT01提高了5.48倍的重组菌株,且其产酶活性可稳定遗传。【结论】通过基因组改组技术获得了2株角蛋白酶活性大幅提高的菌株F3-5和F3-6,这2株菌对羽毛的降解效果较亲本菌株ZJT01明显提高,具有较好的应用前景。