基于Fosmid文库筛选山羊瘤胃微生物源蛋白酶基因及其表达验证

【目的】利用Fosmid文库功能筛选法，获得山羊瘤胃微生物源蛋白酶基因并进行原核表达。【方法】利用功能底物筛选法从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选具有蛋白酶活性的克隆子，对其进行Illumina二代测序，对预测到的基因进行功能注释，根据基因丰度结果确定后续研究的功能基因。利用大肠杆菌BL21(DE3)对功能基因进行诱导表达，对表达产物进行酶活性测定。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，将密码子优化后的功能基因分别敲入枯草芽孢杆菌C6基因组ctc位点并进行表达验证。【结果】从Fosmid文库1 700个克隆子中筛选到1个具有蛋白酶活性的阳性克隆Pro4-C5。通过二代测序技术，鉴定出3个潜在的蛋白酶基因gene0833（内肽酶，EC编号：EC3.4.21.53）、gene0196（金属内肽酶，EC编号：EC3.4.24）和gene0585（羧肽酶，EC编号：EC3.4.17.14）以及1个L-天冬酰胺酶基因（gene0683，EC编号：EC3.5.1.1）。以pET-28a(+)为表达载体，通过大肠杆菌BL21(DE3)原核诱导表达发现，gene0585和gene0196未表达；gene0833表达的蛋白分子质量为87 ku，蛋白酶活性为10.45 U/mL；gene0683表达的蛋白分子质量为37 ku，L-天冬酰胺酶活性为88.52 U/mL，同时发现该蛋白也具有蛋白酶活性，酶活性为5.25 U/mL。将密码子优化后的gene0683和gene0833定点敲入枯草芽孢杆菌C6基因组中表达发现，gene0833未表达，gene0683表达的蛋白酶活性为109.72 U/mL，相比原始菌株（100.97 U/mL）显著提高了8.67%（P＜0.01）；L-天冬酰胺酶活性为31.63 U/mL，相比原始菌株（22.79 U/mL）显著提高了30.06%（P＜0.01）。【结论】从山羊瘤胃微生物源Fosmid文库中筛选和鉴定出了2个具有蛋白酶活性的功能基因（gene0833和gene0683），均来源于微小杆菌属（Exiguobacterium），其中gene0683在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中的表达产物具有较高的蛋白酶和L 天冬酰胺酶酶活性。

Screening and expression verification of rumen-derived protease genes of goat based on Fosmid library