重组人神经生长因子β腺病毒的构建及鉴定

目的]克隆带有His标签的人神经生长因子β基因(human nerve growth factor beta,hNGF"β),并构建hNGF"β与EGFP基因复制缺陷型腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤的应用研究奠定基础。方法]用Trizol试剂提取人胎肝总RNA,应用RT-PCR方法以自行设计的带有His标签的引物来扩增NGF"β基因;将所扩增的NGF"β基因经酶切、纯化,与IRES-EGFP片段共同插入到Pshuttle-cmv载体中,测序后,利用基因同源重组技术构建hNGF基因的复制缺陷型腺病毒载体AdNGF"β,经鉴定,转染HEK293细胞,观察EGFP表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。结果]克隆的hNGF基因序列与GenBank中的hNGF基因序列完全一致并在3′端携带上His标签;重组腺病毒载体AdNGF-β经PacⅠ酶切得到大于23.0和4.5或2.9kb大小的2个片段,表明同源重组成功。2种重组腺病毒经脂质体介导转染293细胞后,均可观察到绿色荧光蛋白。收获病毒并测定感染滴度分别为1.00×109和0.99×109pfu/ml。结论]克隆了带有His标签的hNGF"β基因,并成功构建了重组腺病毒载体,为hNGF蛋白的表达、纯化及对其进行神经损伤研究奠定基础。