基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法

【目的】建立一种能扩增dna J基因全长的PCR检测方法,为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持。【方法】以弧菌dna J基因为靶基因,在其首尾的保守区域设计一对简并引物,经优化退火温度和引物浓度,建立能扩增弧菌接近全长dna J基因的PCR检测方法,并通过特异性试验、灵敏度试验和临床应用评价等验证其适用性。【结果】优化后的PCR反应体系50.0μL:2×F8 Fast Long PCR Master Mix 25.0μL,上、下游引物(20μmol/L)各2.0μL,DNA模板5.0μL,灭菌水补足至50.0μL。扩增程序:94℃预变性3 min;94℃10 s,55℃15 s,72℃15 s,进行35个循环;最后72℃延伸5 min。该PCR检测方法对副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌具有很强的特异性,对弧菌的最低检出限为102CFU/m L。应用建立的PCR检测方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测,结果显示全部为阳性,其中,海水样品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和栖黑海弧菌,对虾样品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌;经测序及同源性比对分析发现,种间菌株的dna J基因序列相似度为79.5%~92.8%,种内菌株间的dna J基因序列相似度为98.2%~99.9%。【结论】基于dna J基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dna J基因,具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点,结合测序技术,可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段。