结球甘蓝雌蕊调控因子SPT与HEC1的克隆及相互作用分析

为研究SPT和HECs及其相互作用对甘蓝雌蕊发育的影响, 以结球甘蓝自交不亲和系E1为材料, 提取雌蕊总RNA, 根据拟南芥中SPT和HEC1基因设计引物, 采用同源克隆的方法克隆SPT基因, 其序列1085 bp, 开放阅读框(ORF) 1062 bp; HEC1基因ORF 696 bp。通过cDNA推导得到的氨基酸序列表明, SPT编码353个氨基酸残基, 预测分子量为37.67 kD, pI为6.83; HEC1编码231个氨基酸残基, 预测分子量为25.26 kD, pI为10.2。分析表明, 两基因在各器官中均表达, 但SPT在果实和雌蕊中表达量最高, 而HEC1在根和花蕾中的表达量最高。为检测两者的相互作用, 构建原核表达质粒pCold I-SPT和pGEX-HEC1, Pull-down试验表明两蛋白能够在体外相互作用。同时构建pGBKT7-SPT、pGADT7-HEC1及互换载体pGBKT7-HEC1和pGADT7-SPT酵母表达载体, 分别转化酵母Y2HGold和Y187感受态细胞后均未出现自激活和毒性现象, 融合后的二倍体酵母均能在SD/–Trp–Leu–Ade–His/X-α-gal/AbA板上长出蓝色菌斑, 表明SPT和HEC1能够相互作用激活下游的HIS3、AUR1-C、MEL1和ADE2报告基因, 酵母双杂交试验结果与Pull-down检测一致, 说明SPT和HEC1能够相互作用以调控雌蕊的发育。