| 金属络合剂酸性络蓝K在TNOS-LAMP可视化检测体系中的应用 |
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| 引用本文： | 汪小福,付振芳,李玥莹,陈笑芸,彭城,徐晓丽,魏巍,徐俊锋.金属络合剂酸性络蓝K在TNOS-LAMP可视化检测体系中的应用[J].农业生物技术学报,2016(9):1374-1383. |
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| 作者姓名： | 汪小福 付振芳 李玥莹 陈笑芸 彭城 徐晓丽 魏巍 徐俊锋 |
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| 作者单位： | 1. 浙江省农业科学院浙江省植物有害生物防控重点实验室,杭州,310021;2. 浙江省农业科学院浙江省植物有害生物防控重点实验室,杭州310021;沈阳师范大学化学与生命科学学院,沈阳110034;3. 沈阳师范大学化学与生命科学学院,沈阳,110034 |
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| 基金项目： | 浙江省公益性项目(No.2014C22001;No.2015C32063)和浙江省自然科学基金项目(No.LY15C200011) |
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| 摘 要： | 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种快速、灵敏度高和特异性强的等温核酸扩增技术,已被广泛用于各领域.与此同时,高灵敏度也使得扩增时极易出现交叉污染,而利用闭管检测技术能有效降低其污染机率.本研究引入了一种新型的金属指示剂-酸性络蓝K (acid chrome blueK,ACBK),建立了闭管LAMP扩增和检测结果可视化检测技术.首先,本研究分别在LAMP 扩增的起始体系中,先后分别测试ACBK与缓冲液、dNTPs、引物和Mg2+等组分反应,确定了含有ACBK的LAMP体系中的颜色变化由Mg2+决定,化学方法也进一步验证了这一结论.随后,对LAMP检测体系中的ACBK指示剂的浓度及Mg2+的浓度进行了选择和优化,最终选定25 μL扩增体系中ACBK的检测浓度为:2 μL 0.04％ ACBK,Mg2+浓度为:6 mmol/L.以胭脂碱合成酶基因终止子(terminator of nopaline synthase gene,TNOS)为靶基因,建立了TNOS-ACBK-LAMP检测体系.建立的体系的检测灵敏度针对转基因水稻的检测限为100拷贝,在分别含有50 ng的水稻(Oryza sativa)、大豆(Glycine max)、油菜(Brassica napus)和玉米(Zea mays)基因组中能检测出0.1％的转基因含量.同时,利用不同转化事件及不同作物的转基因材料验证了其检测特异性,结果表明,构建的TNOS-ACBK-LAMP的检测系统具有很强的检测特异性.最终,将该检测体系成功用于对实际玉米样品转基因成分的检测,检测结果既可以裸眼直接判断也可以借助紫外可见光谱分析.该方法的建立为可以加快转基因成分检测的速度,同时也为等温扩增方法的判断提供了新的思路.
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| 关 键 词： | 环介导等温扩增(LAMP) 酸性络蓝K(ACBK) 金属指示剂 可视化 胭脂碱合成酶基因终止子(TNOS) |
Application of Metal Indictor Acid Chrome Blue K in TNOS-LAMP Visual Detection System |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Loop mediated isothermal amplification (LAMP) Acid chrome blue K (ACBK) Metal indicator Visualization Terminator of nopaline synthase gene(TNOS) terminator |
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