| 摘 要： | 为建立检测F亚群禽白血病病毒(ALV-F)的SYBR Green I荧光定量PCR方法,本研究以ALV-F分离株FGD1803基因组为模板,PCR扩增其env基因,构建重组质粒pMD18-T-F作为标准品。利用该重组质粒建立了SYBR Green I荧光定量PCR方法(qPCR)的标准曲线,并经反应条件优化建立了检测ALV-F的qPCR方法。建立的标准曲线结果显示,重组质粒标准品的拷贝数与Ct值呈良好的线性关系,R2为0.993,扩增效率为1.03。该方法各反应条件的优化结果为10μmol/L上下游引物各0.5μL,退火温度为55℃。特异性试验结果显示,该方法仅能特异性检测ALV-F,而对ALV-A、ALV-B、ALV-J、ALV-K、ALV-E、网状内皮增生病病毒、马立克氏病病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、鸡支气管炎病毒等禽源病毒无交叉反应;敏感性试验结果显示,该方法对质粒标准品的最低检测限为1.16×102拷贝/μL,敏感性是常规PCR方法的100倍;以3个不同浓度重组质粒标准品为模板进行重复性试验,结果显示批内和批间重复性试验变异系数均小于5%;利用该方法与病毒培养方法分别检测30份七彩山鸡血浆样品(21份ALV阳性,9份阴性)的细胞培养物,结果显示该qPCR方法的阳性检出率为33.3%(10/30),常规PCR方法的阳性检出率为20.0%(6/30),病毒分离方法的阳性检出率为13.3%(4/30),该qPCR方法与病毒分离方法的符合率为80.0%。本研究在国内首次建立了用于ALV-F检测的qPCR方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以用于临床样品的检测。为该病毒的检测提供了技术支撑。
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