水稻草状矮化病毒基因组RNA1-3的分子生物学

水稻草状矮化病毒(以下简称水稻草矮病毒，Rice grassy stunt virus，RGSV)，是纤细病毒属(Tenuivirus)的一个成员，病毒粒体丝状，由核衣壳蛋白和基因组RNA组成。该病于20世纪70年代曾在南亚、东南亚大面积发生，给当地的水稻生产造成严重损失，在我国的福建、台湾、广东、广西和海南等地也有分布。与同属病毒其它成员相比，RGSV分子生物学研究进展较为缓慢，直至1998年才报道病毒基因组全序列，其基因组包含6个ssRNA片段，其中RNA1，2，5和6分别对应于纤细病毒属其它病毒的RNA1-4。6个片段均采用双义编码策略。这不仅在纤细病毒属中，在植物病毒中也是独特的。有鉴于此，本文对水稻草矮病毒沙县分离物(RGSV-SX)RNA1-3的分子生物学及部分基因功能进行了研究(RGSV-SX RNA1-3全长序列已递交GenBank登录，登录号分别为：AF509470、AF511072、AF397468)。根据RGSV菲律宾北方分离物(RGSV-IR)序列设计合成引物，通过RT-PCR获得了覆盖RGSV-SX基因组RNA1-3的cDNA克隆。序列分析结果表明，RGSV-SX分离物RNA1长9764个核苷酸，与已发表的RGSV菲律宾IR、SC分离物相比，核苷酸序列同源性均为99．6％，其中，NS1蛋白三个分离物间的氨基酸序列同源性为100．0％、RdRP氨基酸序列同源性分别为95．0％、95．0％、99．0%；RNA2全长4071个核苷酸，RNA2与IR、SC分离物的核苷酸序列同源性分别为97．6％、99．3％，NS2氨基酸序列同源性分别为99．5％、99．0%，NSvc2氨基酸序列同源性分别为96．3％、96．9％；RNA3的全长为3120个核苷酸，整个片段与IR、SC分离物的核苷酸序列同源性分别为98．7％、91．0%，NS3氨基酸序列同源性分别为98．4％、96．4%；NSvc3氨基酸序列同源性分别为99．2％、81．9％。对RGSV各分离物(SX、IR、SC)间RNA1-6核苷酸序列同源性进行多重比较结果表明，RGSV存在明显的重排现象，不同分离物的相应RNA片段存在积累突变的差异。以RNA2、RNA3变异程度较大，SX的RNA2与IR变异较大，变异率达2．36％，更接近于SC分离物，而SX的RNA3-6则与IR分离物更接近，SX的RNA1与IR、SC有变异，但变异不大，且三个分离物间的变异主要发生在基因间隔区。这些结果表明，SX与IR同源性更高，二者具有较近的亲缘关系，而与SC的差异较大，这在分子水平上也进一步确定了SX与IR分离物相近，而与SC分离物相差较远，由此可以推测，我国沙县分离物SX可能来源于菲律宾北方分离物(IR)，并在流行过程中经介体昆虫传播发生了较少的基因内重排或变异。对RGSV-SX的vRNA3 ORF片段进行克隆、原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达，并制备了抗血清，为进一步开展NS3基因及它所编码蛋白的功能研究打下基础。通过建立水稻原生质体培养体系，经聚鸟氨酸(PLO)介导将提纯的水稻草矮病毒(RGSV)接种到水稻原生质体内，按不同时间取样，提取其总蛋白，以RGSV抗血清、制备的NS3融合蛋白抗血清及提纯的病害特异性蛋白SP(NS6)抗血清为探针，采用酶联免疫吸附法(ELISA)和蛋白免疫印迹法(Western-blot)，研究RGSV在水稻原生质体内的表达周期。构建了含NS3基因的植物表达载体pCBTNSv3，转化农杆菌，用以转化水稻的研究。在实验过程中详细比较了根癌农杆菌转化水稻的各种条件，建立了农杆菌介导的水稻转化的优化系统，克服了再生植株难的问题，获得了转RGSV NS3的水稻转基因再生植株，经鉴定，初步证实NS3基因已整合到水稻的基因组中。

Molecular Biology of RNA1-3 of Rice Grassy Stunt Virus