粪肠球菌来源内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的重组表达及催化特性

内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(endo-β-N-acetylglucosaminidase,Endo/ENGase,EC3.2.1.96)是一类特异性识别并切割N-连接聚糖核心结构中两个N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,Glc NAc)之间的β-1.4-糖苷键的糖苷酶,广泛应用于蛋白质N-糖基化分析。为表征粪肠球菌(Enterococcus faecalis)来源的内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的酶学特性,本研究通过PCR扩增粪肠球菌内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因endoEf,并通过无缝克隆的方式构建原核表达载体pET-28a-endoEf,在实现重组表达和纯化的基础上对EndoEf蛋白的催化特性及关键催化残基进行分析。结果表明,EndoEf可在大肠杆菌中以可溶形式高效表达,经钴离子亲和层析可获得高纯度的目标蛋白,每升菌液可纯化202.1 mg目标蛋白;以RNase B为底物,其比活力为1.0×10~4U/mg。EndoEf包含保守基序DXDXE,属于糖苷水解酶18(glycoside hydrolases 18,GH18)家族,可以酶切天然及变性状态下的核糖核酸酶B(ribonuclease B,RNase B)和鸡卵清蛋白(ovalbumin,Ova);基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF-MS)进一步证明了EndoEf对RNase B上N-连接糖链的水解。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)显示,EndoEf表观分子量为30.2 kD。酶学性质分析表明,EndoEf最适温度为40℃,最适pH范围为5.0~7.0;在温度为40~50℃、pH 7.0~9.0之间具有较好的稳定性,可耐受1 mol/L NaCl、100 mmol/L DTT、2%SDS和2%Triton X-100。定点突变技术构建EndoEf的3个突变体D125N、D127N和E129Q,并对突变体酶活性进行分析表明,E129Q活性几乎完全丧失,D127N丧失大部分水解活性,而D125N没有明显活性改变,说明EndoEf的129位谷氨酸是催化必须氨基酸。EndoEf重组表达体系的建立和酶学性质的分析为其在糖蛋白研究中的实践应用提供了科学依据。