双表达去势DNA疫苗的构建及其稳定性研究

试验旨在构建一种更安全有效的新型免疫去势DNA疫苗，通过选取下丘脑-垂体-性腺轴（hypot halamic-pituitary-gonadal axis，HPG）的上游调控基因吻素1（KISS1）和促性腺激素释放激素（GnRH）作为靶标，借助2A肽的自剪切功能，引入平衡致死系统代替抗性基因筛选流程，成功将GnRH和KISS1转入非抗性筛选质粒pVAX-asd中，酶切验证和测序对比验证目的基因的插入方向和序列完全正确。重组质粒转染HeLa细胞，反转录后扩增目的基因结果显示，重组质粒在真核细胞内能够正常转录，保证重组质粒在导入机体后能够正常表达，从而引起特异性免疫反应。将构建成功的质粒转入减毒的猪霍乱沙门氏菌C500中，获得可直接口服免疫的活载体疫苗，酶切和测序结果表明，双表达重组质粒成功导入工程菌中。将活菌疫苗在体外连续传代50次，选取0、2、5、10、20、30、40、50代的菌株进行稳定性研究，生长曲线检测结果表明，工程菌在体外连续传代50次的过程中，其生长特性无明显变化，且与减毒猪霍乱沙门氏菌C500的生长特性一致，未因携带质粒发生明显变化；同时将各代菌液扩增沙门氏菌标志基因（invA）和毒力基因（crp），结果表明多次传代后工程菌仍然具有沙门氏菌的特性，其减毒特性也无变化。各代菌液质粒酶切验证显示，多次传代并不影响质粒的稳定性，重组双表达质粒能够在沙门氏菌C500中维持正常拷贝功能。综上所述，该重组质粒和工程菌疫苗均具有良好的稳定性，可直接应用于动物免疫去势的研究。

Construction and Stability Study of Co-expression Castration DNA Vaccine