嗜吞噬细胞无浆体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用 |
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引用本文: | 崔艳艳,王晓星,张艳,史柯,菅复春,张龙现,王荣军,宁长申.嗜吞噬细胞无浆体SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽医学报,2018(4). |
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作者姓名: | 崔艳艳 王晓星 张艳 史柯 菅复春 张龙现 王荣军 宁长申 |
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作者单位: | 河南农业大学牧医工程学院 |
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摘 要: | 为建立荧光定量PCR方法检测嗜吞噬细胞无浆体(Anaplasma phagocytophilum),针对GenBank A.phagocytophilum 16S rRNA基因保守序列(JN558815),设计1对引物1-25F/183-205R。以已知引物EE1/EE2和该引物进行巢式PCR扩增出预期大小片段(205bp),构建含有16S rRNA基因的重组质粒,以质粒为模板构建了标准曲线。以1-25F/183-205R为荧光定量PCR引物,建立A.phagocytophilum荧光定量PCR检测方法,并进行特异性、敏感性、重复性试验和临床样本检测。结果表明,该方法在6.4×10~3~6.4×10~8 copies/μL相关系数为0.99,显示出良好的线性关系;所建方法能特异地检出A.phagocytophilum,对绵羊无浆体、牛无浆体和环形泰勒虫基因组DNA和灭菌双蒸水均无交叉反应;可检测到6.4×10~2 copies/μL的标准质粒DNA,比常规PCR敏感性高100倍;批内及批间变异系数均低于2.0%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法对30份羊血液临床样品检出率比巢式PCR高16.67%。该研究为A.phagocytophilum临床检测和定量分析病原感染程度奠定理论基础。
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关 键 词: | 嗜吞噬细胞无浆体 荧光定量PCR 16S rRNA基因 |
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