柑橘全爪螨微卫星位点鉴定与信息分析

【目的】通过磁珠富集法构建柑橘全爪螨(Panonychus citri)微卫星富集文库,发掘柑橘全爪螨基因组微卫星(g SSR)序列。同时,利用柑橘全爪螨转录组数据库,筛选其功能微卫星(EST-SSR)分子标记,设计柑橘全爪螨微卫星(SSR)引物并验证其适用性。【方法】在提取柑橘全爪螨高质量基因组DNA的基础上,使用链霉亲和素偶联的磁珠与生物素标记的微卫星探针结合,亲和性捕捉由限制性内切酶酶切产生的含SSR的单链基因组DNA目的序列,经PCR扩增为双链后,克隆并构建SSR富集文库,测序筛选SSR序列。另一方面,基于柑橘全爪螨转录组数据,利用msatcommander软件发掘其功能微卫星标记。采用Primer Premier 5软件设计SSR引物,并进行验证。【结果】构建了柑橘全爪螨AC、TC和ATG共3个SSR富集文库,阳性克隆率分别约为30%、28%和25%。对文库的测序结果表明,AC文库的冗余率最高,TC文库次之,而ATG文库未发现相同微卫星位点的克隆。同时,在AC文库中,大部分AC重复类型的SSR为多拷贝微卫星位点,其中有相当一部分SSR的一侧侧翼序列完全相同或高度相似。从3个SSR富集文库中获得了可用于设计引物的g SSR单一序列44条(Gen Bank登录号为JF776418—JF776461),共合成了20对SSR引物,其中能够稳定扩增的引物有11对。柑橘全爪螨g SSR中完美型SSR占54.5%,非完美型和复合型SSR分别占27.3%和18.2%。在完美型的g SSR中,两碱基重复SSR的核心重复次数(13—42次)大于三碱基重复SSR(5—9次)。从柑橘全爪螨转录组数据库中共获得8 023个EST-SSR位点,其中2 540个SSR可用于引物设计,共合成了35对引物(Gen Bank登录号为KT261306—KT261340),其中能够稳定扩增的引物有8对。柑橘全爪螨EST-SSR的平均分布频率为1/3.55 kb。其中,三碱基为优势核心重复类型,占总数的53.86%;其次为两碱基核心重复类型,占总数的43.36%;而四、五、六碱基重复类型以及复合型的SSR数量均较少,且数量差异不大,共占EST-SSR总数的2.78%。柑橘全爪螨EST-SSR核心重复次数主要集中在5—10次。【结论】采用磁珠富集法,并将酶切、接头连接一步化,可提高个体微小的螨类及微小昆虫SSR的富集效率。柑橘全爪螨g SSR核心重复次数要远多于从转录组数据库获得的EST-SSR。总体而言,g SSR和EST-SSR中的三碱基重复SSR具有更好的优化率。此外,柑橘全爪螨g SSR具有微卫星家族现象。