家蚕碱性磷酸酶原核表达纯化、结构与活性分析

【目的】碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶。不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关。研究家蚕(Bombyx mori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据。【方法】取5龄3 d家蚕中肠组织,利用Trizol法提取总RNA,然后以其为模板反转录合成cDNA。以家蚕中肠cDNA为模板,利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物,通过PCR克隆BmALP。将BmALP与不同的表达载体分别进行双酶切,然后连接并转化表达菌株,利用大肠杆菌表达重组蛋白。比较不同表达载体在上清中的表达情况,选择可溶性重组蛋白表达最好的载体,利用Origami B(DE3)细胞大量表达重组蛋白,借助Ni-NTA亲和层析纯化重组的His-Trx-BmALP蛋白,然后加入Prescission蛋白酶在4℃酶切20 h,再次利用Ni-NTA亲和层析去除融合标签His-Trx。利用凝胶过滤层析分析BmALP分子量及其在溶液中的状态,利用圆二色光谱研究BmALP的二级结构及其随温度的变化。通过酶活分析研究BmALP的最适pH、最适温度、Km、结构稳定性及金属离子对其酶学活性的影响。【结果】从家蚕中肠组织提取了总RNA,反转录合成了cDNA,并以该cDNA为模板成功克隆了BmALP。分别构建了BmALP的pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C 3种表达载体。表达分析发现,pET32M.3C载体有助于重组的融合蛋白His-Trx-BmALP以可溶性蛋白的形式在细胞裂解后的上清液中表达,然后利用pET32M.3C载体大量表达重组蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析纯化获得了可溶性的His-Trx-BmALP。加入Prescission蛋白酶酶切,再次通过Ni-NTA亲和层析去除了融合标签His-Trx。凝胶过滤分析显示BmALP在溶液中形成稳定的二聚体结构。圆二色光谱研究表明BmALP包含有α-螺旋结构,其含量随温度的升高逐渐减少。酶活分析揭示BmALP的最适pH和最适温度分别为11.0和45℃。测定BmALP的Km值为1.40 mmol·L~(-1)。在10℃处理2 h后,BmALP的残余活性最高;35℃处理2 h后,其活性完全丧失。Mg2+和Zn2+促进了BmALP催化反应的进行,其最适浓度分别为40和5 mmol·L~(-1)。在20 mmol·L~(-1)浓度范围内,Cu2+激活了BmALP活性,其中10 mmol·L~(-1)时激活效果最好,浓度超过20 mmol·L~(-1)时,Cu2+则抑制了BmALP活性。【结论】克隆了家蚕碱性磷酸酶基因BmALP,表达纯化了BmALP蛋白并分析了其结构和性质,为深入研究其结构和功能打下了基础。