鸭呼肠孤病毒基因Ⅰ型与Ⅱ型鉴别诊断RT-PCR方法的建立与应用

临床发病鸭(Anas platyrhynchos domestica)群中存在两种基因型鸭呼肠孤病毒(Duck reovirus,DRV)的感染.为建立一种能鉴别诊断DRV Ⅰ型(classical DRV,C-DRV)与Ⅱ型(novel DRV,N-DRV)的一步法RT-PCR检测方法,本研究通过对GenBank已公布的现有C-DRV和N-DRV S1和S4基因片段序列进行比对分析,设计合成两对特异性引物,并对引物浓度、退火温度和循环次数等扩增条件进行优化,建立一种能鉴别诊断C-DRV和N-DRV的一步法RT-PCR检测方法.结果表明,一步法RT-PCR最佳的反应体系为:PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1μL,2×1 Step Buffer 12.5μL,RNA模板1.5μμL,上下游引物(20μmol/L)各1μL,RNase Free dH2O补足25 μL;最佳反应条件:50℃反转录30 min;94℃预变性2 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共30个循环.该方法可从C-DRV和N-DRV基因组中扩增出大小分别为249和505 bp单一特异性片段,从两种病毒基因组混合物中可同时扩增出两条特异性片段,而对鸭源常见病毒及正常细胞基因组在同等条件下检测均为阴性;该方法具有较高的敏感性,其最低病毒检出量分别为0.47和0.62个半数组织培养感染剂量(50％ tissue culture infective dose,TCID50);对不同代次、不同时间提取的病毒RNA样品重复检验3次,结果均一致.对浙江省2011～2015年采集的239份疑似临床病料进行检测,C-DRV与N-DRV的阳性率分别为2.5％(6/239)和31.4％(75/239);通过对阳性病料P10和P18扩增序列的测序也证实检测结果的准确性.本研究建立的双重一步法RT-PCR可以有效区分两种基因型DRV,且临床样品检测表明N-DRV是浙江省流行的优势基因型.本研究为鉴别诊断C-DRV与N-DRV提供了一个快速、灵敏性高及低成本的实验室诊断方法,该方法的建立可为DRV的分子流行病毒学调查提供有效的技术支持.