绿盲蝽TRPA1基因的鉴定及功能分析

【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）TRPA1基因，明确其在成虫不同组织中的表达分布，研究绿盲蝽TRPA1基因的功能，阐明绿盲蝽感受温度的分子基础。【方法】在绿盲蝽转录组测序的基础上，通过生物信息学方法分析转录组数据,得到编码绿盲蝽TRPA1基因的cDNA序列片段。根据已知的cDNA序列，设计引物。采用RT-PCR及RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆TRPA1基因的全长序列，并通过DNAMAN软件及BLAST分析测序结果。测序正确后，使用在线工具SMART及TMpred预测TRPA1蛋白的锚蛋白重复序列（Ankyrin repeats）及跨膜结构域序列。通过序列比对，构建昆虫TRP（transient receptor potential）通道的家族进化树，分析绿盲蝽TRPA1与其他物种同源基因的相似性及进化地位。以GADPH为内参基因，利用RT-PCR检测绿盲蝽TRPA1在成虫触角、头、喙、足、腹等不同组织中的相对表达量。通过爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳记录技术研究绿盲蝽TRPA1对温度刺激的反应。【结果】通过绿盲蝽转录组数据预测得到TRPA1基因的4个cDNA序列片段，经过RT-PCR及RACE技术克隆得到了绿盲蝽TRPA1的全长序列，并命名为AlucTRPA1。AlucTRPA1开放阅读框全长3 672 bp，编码1 223个氨基酸。通过在线工具SMART及TMpred预测分析结果表明，AlucTRPA1含有16个锚蛋白重复序列结构及6个保守的跨膜结构域。序列比对及进化树分析结果显示，昆虫TRPA家族包含TRPA1、Painless、Pyrexia及Water witch，AlucTRPA1属于昆虫TRPA1亚家族。AlucTRPA1与其他昆虫的同源基因具有很高的相似性，特别是与同属半翅目的豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）的同源性高达65.1%。成虫组织表达谱分析结果表明，AlucTRPA1在成虫触角中的表达量最高，头、喙、足、腹中也都有表达。爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳记录结果表明20℃至40℃逐渐上升的温度可以直接激活AlucTRPA1通道，且两次连续重复的温度刺激未引起AlucTRPA1通道的钝化。【结论】AlucTRPA1在绿盲蝽成虫的触角、头等组织中均有表达，且在爪蟾卵母细胞表达的AlucTRPA1能被20℃至40℃逐渐上升的温度刺激直接激活，推测AlucTRPA1在绿盲蝽体内是直接的温度感受器，参与调控绿盲蝽对生活环境温度的感知行为。

Identification and Functional Characterization of TRPA1 in Apolygus lucorum (Meyer-Dür)