| 蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备 |
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| 引用本文： | 张涛,罗维玉,姜水涛,朱鹏阳,李呈军,陈化兰,孙晓林,姜丽.蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备[J].甘肃农业大学学报,2016(1):7-12. |
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| 作者姓名： | 张涛 罗维玉 姜水涛 朱鹏阳 李呈军 陈化兰 孙晓林 姜丽 |
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| 作者单位： | 1. 甘肃农业大学动物医学院,甘肃 兰州 730070;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江 哈尔滨 150001;2. 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,农业部动物流感重点开放实验室,黑龙江 哈尔滨 150001;3. 甘肃农业大学动物医学院,甘肃 兰州,730070 |
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| 基金项目： | 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(03022014001)，国家自然基金青年基金(31402206) |
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| 摘 要： | 【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.
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| 关 键 词： | PKR 原核表达 蛋白纯化 多克隆抗体 |
Prokaryotic expression,purification and polyclonal antibody preparation of protein kinase R |
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