CRISPR/Cas9系统敲除山羊CDK2基因载体构建及转染效率检测

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶-2(CDK2)是细胞通过和进入S期所必须的细胞周期调节激酶，与许多癌细胞的生长有关。然而，目前在山羊上关于CDK2基因敲除及相关功能的研究尚未见报道。研究采用CRISPR/cas9系统，首先设计CDK2基因的sgRNA片段，在合成CDK2 sgRNA核苷酸序列后，构建能够同时表达sgRNA和Cas9 D10A的质粒PYSY-CDK2 sgRNA，连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，对转化子进行验证，最后转染HEK293T细胞，检测细胞荧光和细胞增殖。酶切和测序结果证明，CDK2基因敲除载体构建正确；荧光显微镜检测显示，细胞转染效率在75%以上；细胞增殖检测表明，山羊CDK2敲除质粒不会对人源细胞增殖产生影响。说明采用CRISPR/Cas9构建的载体，可为后续获得山羊CDK2基因缺失型细胞系，研究支原体肺炎感染引发的细胞凋亡分子机制提供理论依据。