LBD家族转录因子TtRa2和AtLBD37的表达与纯化

【目的】由于LBD基因编码一类植物特有的空间结构尚未解析的转录因子,拟建立2种LBD家族成员(TtRa2和AtLBD37)及其DNA结合结构域的高效表达与纯化体系,为该家族转录因子的结晶研究奠定基础。【方法】以pET-21a表达载体为基架,设计并构建了pHMT载体,该载体在目标基因上游依次融合了His-tag、MBP和TEV蛋白酶酶切位点。将TtRa2和AtLBD37基因的完整编码区及其DNA结合结构域编码区分别插入pHMT载体,获得重组质粒pHMT-AtLBD37、pHMT-AtLBD37-BD、pHMT-TtRa2、pHMT-TtRa2-BD。将上述质粒导入E.coli表达菌株2566诱导表达,先使用amylose亲和柱纯化获得融合蛋白,再用融合His-tag的TEV蛋白酶切除融合蛋白TtRa2-BD中的His6-MBP双标签,使用Ni-NTA亲和层析柱去除TEV蛋白酶和His6-MBP标签,最后获得目标蛋白。【结果】TtRa2和AtLBD37及其DNA结合结构域均获得了高效可溶性融合表达,其表达量占细胞总蛋白的50%~70%;TtRa2-BD经2步亲和纯化后,每升菌液可获得15mg纯度大于98%的目标蛋白。【结论】成功建立了2种LBD转录因子及其DNA结合结构域的高效表达和纯化体系。