牛奶中牛DNA提取试剂盒法的建立

【目的】提高牛奶中牛DNA的分离提取效率,建立稳定的牛奶中牛DNA提取的试剂盒法。【方法】以从牧场中采集的新鲜牛奶为材料,在前期建立的牛奶中牛DNA提取方法基础上,针对消化温度(55,60,65℃)、消化时间(10,60,120,180,240 min)、质量分数20%十二烷基硫酸钠(SDS)裂解液用量(20,35,50,65,80μL)、20 mg/mL蛋白酶K用量(0,10,30,50,70μL)等重要参数依次进行优化,通过DNA品质测定筛选最佳的DNA提取条件,建立稳定的牛奶中牛DNA提取的试剂盒方法,并用深加工的奶粉和高低温液态奶制品对试剂盒方法进行验证。【结果】不同消化温度和消化时间从牛奶中提取的总DNA、线粒体DNA(mtDNA)和核DNA(nDNA)的完整性均表现良好,但不同消化温度和消化时间的DNA质量浓度和纯度存在差异,在消化温度为60℃、消化时间为10 min、SDS裂解液用量为50μL、蛋白酶K用量为50μL时,提取的DNA品质较优,是最佳的DNA提取条件,该条件下DNA平均质量浓度为97 ng/μL,平均纯度为1.44。对优化指标后建立的试剂盒方法进行验证,结果表明该方法不仅适用于生鲜牛奶,而且还适用于液态和固态奶制品。【结论】在所获得的最佳DNA提取条件下,牛奶体细胞裂解充分、完全,所提DNA质量浓度和纯度较高,完整性较好,PCR扩增性能较强。建立的牛奶中牛DNA提取试剂盒法适用范围较广。

Establishment of DNA kit method of bovine milk