桃PGIP蛋白基因片段的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆桃（Prunus persica）多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting protein，PGIP）基因，并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物，以桃叶片总RNA为模板，通过RT-PCR获得了约1 kb的cDNA片段，T/A克隆后进行序列测定，并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中，构建融合表达质粒，转化到Escherichia coli Rosetta-gami（DE3）pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示，桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区长993 bp，编码330个氨基酸残基，命名为Pppgip。PpPGIP分子量为36.4 kD，等电点为7.42，信号肽为N端24个氨基酸残基，具有7个潜在的N-糖基化位点。Pppgip与李属其它pgip核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.2%～94.6%和89.7%～92.7%。同源树分析表明，该基因明显区别于其它pgip，与马哈利樱桃pgip的关系较近，与寿星桃、桃栽培品种‘久保’等pgip的关系都较远。该基因所编码的蛋白质的三维结构含11个α-螺旋和21个β-折叠，中心LRR结构域由10个串联的LRRs基序组成。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明，重组蛋白主要以包涵体形式出现。【结论】克隆了桃PGIP基因，并可在大肠杆菌中表达。

Molecular Cloning, Sequence Analysis of Polygalacturonase-Inhibiting Protein Gene from Prunus persica and Its Expression in E.coil