Thin-layer chromatography of vitamin B12 and its analogues

Summary The separation of vitamin B₁₂ from its analogues is difficult because they are chemically closely related to cyanocobalamin.On the grounds of our experiments we suggested a new method for the separation of corphyrins on dry alumina (basic, second degree of activity according toBrockmann). As solvent system the mixture of isobutanol, isopropanol and water (1 : 1 : 1) was used. The separation with good compact spots was obtained of the following corphyrins: cyanocobalamin (vitamin B₁₂), factor B_{12 III}, pseudovitamin B₁₂, factor A, factor B and factor V (nB).A new simple and rapid method for separation of hydroxocobalamin and cyanocobalamin on thin layer of dry alumina (neutral, second degree of activity according toBrockmann) was reported by us. Advantage was taken of the property of hydroxocobalamin to form with NH₄ OH a compound of the cobalichrome type. Under these conditions cyanocobalamin does not change so that both compounds can be easily separated.The best separation was obtained by mixture of isobutanol, isopropanol and water (1.5 : 1 : 1.25) as solvent system (with addition of NH₄ OH until the ph was 8.5).On the grounds of the results from attempts on the separation of cyanocobalamin from its analogues we reported a method for quantitative determination of vitamin B₁₂ in microbial fermentations, commercial preparations, and concentrates. The method involved the precipitation of vitamin B₁₂ and other analogues (accompanying it) as coper-cyanide complexes, the decomposition of complexes with addition of NaCN-solution to obtain the dicyanocomplexes, the separation of cyanocobalamin on thin layer of dry alumina and its colorimetric determination to 361 nm.

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Zusammenfassung Die Trennung des Vitamin B₁₂ und seiner Abkömmlinge ist wegen der großen Ähnlichkeit mit dem Cyanocobalamin schwierig. Basierend auf unsere Experimente schlagen wir eine neue Methode zur Trennung der Corphyrine auf Tonerde (basisches Aluminiumoxid, 2. Aktivitätsgrad nachBrockmann) vor. Als Lösungsmittel wird eine Mischung Isobutanol, Isopropanol und Wasser 1 : 1 : 1 benutzt. Eine Trennung mit scharf begrenzten Flecken der folgenden Corphyrine wurde erhalten: Cyanocobalamin, Faktor B_{12 III}, Pseudovitamin B₁₂, Faktor A, Faktor B und Faktor V (nB).Eine neue, einfache und rasche Methode zur Trennung der Hydroxocobalamine und der Cyanocobalamine auf Dünnschicht mit trockener Tonerde (neutrales Aluminiumoxid, 2. Aktivitätsgrad nachBrockmann) ist von uns beschrieben worden. Man benutzte die Eigenschaft der Hydroxocobalamine, mit NH₄OH eine Verbindung der Gruppe der Cobalichrome zu bilden. In diesem Fall verändert sich das Cyanocobalamin nicht, so daß die zwei Verbindungen leicht getrennt werden können. Die beste Trennung wurde mit der Mischung Isobutanol, Isopropanol und Wasser (1,5 : 1 : 1,25) als Lösungsmittel erhalten (mit Zusatz von NH₄OH, bis pH = 8,5).Auf Grund der Trennungsergebnisse der Cyanocobalamine von verwandten Stoffen wird eine Methode quantitativer Bestimmung des Vitamin B₁₂ in mikrobiellen Gärungen, in Handelspräparaten und in Konzentraten beschrieben. Diese Methode schließt die Fällung des Vitamin B₁₂ und anderer Abkömmlinge als Kupfer-Cyan Komplexe, die Zersetzung der Komplexe durch Zusatz einer Lösung NaCN, um Dicyan-Komplexe zu bekommen, die Trennung der Cyanocobalamine auf Dünnschicht mit trockener Tonerde und deren kolorimetrische Bestimmung bei 361 nm ein.

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Résumé La séparation de la vitamine B₁₂ d'avec ses analogues est difficile du fait de leur grande similitude avec la cyanocobalamine.En nous basant sur nos expériences nous avons suggéré une nouvelle méthode de séparation des corphyrines sur de l'alumine anhydre (alumine basique, du 2ème degré d'activité selonBrockmann). Comme système solvant un mélange isobutanol, isopropanol, eau, (1 : 1 : 1) a été employé. Une séparation avec des tâches bien délimitées des corphyrines suivantes fut obtenue: cyanocobalamine (vitamine B₁₂), facteur B_{12 III}, pseudovitamine B₁₂, facteur A, facteur B et facteur V (nB).Une nouvelle méthode, simple et rapide, de séparation d'hydroxocobalamine et de cyanocobalamine sur couche mince d'alumine anhydre (alumine neutre, du 2e degré d'activité selonBrockmann) fut décrite par nous. On a utilisé la propriété de l'hydroxocobalamine de former avec le NH₄ OH un composé appartenant au type des cobalichrome. Dans ces conidtions la cyanocobalamine ne subit pas de modifications, de sorte que les deux composés peuvent être facilement séparés. La meilleure séparation fut obtenue à l'aide du mélange isobutanol, isopropanol, et eau (1,5 : 1 : 1,25) comme système solvant (avec addition de NH₄ OH jusqu'à pH 8,5).Sur la base des résultats des essais de séparation de la cyanocobalamine d'avec ses analogues on décrit une méthode pour la détermination quantitative de la vitamine B₁₂ dans les fermentations microbiennes, les préparations commerciales, et les concentrés. La méthode implique la précipitation de la vitamine B₁₂ et d'autres analogues l'accompagnant, sous forme de complexes cuivre-cyanure, la décomposition des complexes par l'addition d'une solution de Na CN afin d'obtenir des di-cyano-complexes, la séparation de la cyanocobalamine sur couche mince d'alumine anhydre et sa détermination colorimétrique à 361 nm.