| 稻瘟菌CYP51蛋白表达、纯化及其与抑制剂的复合体的结晶条件筛选 |
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| 引用本文： | 张秀娟,张峰.稻瘟菌CYP51蛋白表达、纯化及其与抑制剂的复合体的结晶条件筛选[J].植物保护学报,2023,50(4):873-882. |
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| 作者姓名： | 张秀娟 张峰 |
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| 作者单位： | 南京农业大学植物保护学院, 南京 210095 |
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| 基金项目： | 中央高校基本科研业务费专项资金（KYGD202110），江苏省六大人才高峰高层次人才项目（NY-035） |
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| 摘 要： | 为阐明稻瘟菌Magnaporthe oryzae甾醇14α-脱甲基酶（sterol 14α-demethylase，CYP51）与抑制剂的互作机制，首先通过分子生物学软件预测并分析稻瘟菌CYP51蛋白的跨膜域、二级结构以及氨基酸序列保守性，对CYP51蛋白的氮端跨膜域序列进行截除处理并以此构建蛋白表达质粒；其次对表达质粒进行原核表达，并使用亲和层析、酶切、透析和凝胶过滤层析等多种蛋白纯化手段得到目的蛋白；最后利用坐滴法对CYP51蛋白与抑制剂的复合体的结晶进行筛选。结果表明，稻瘟菌CYP51A和CYP51B蛋白均有两段跨膜域，在不破坏CYP51蛋白底物和抑制剂结合区域的前提下，将稻瘟菌CYP51A蛋白氮端1~100位氨基酸以及稻瘟菌CYP51B蛋白氮端1~110位氨基酸截除，构建蛋白表达质粒pET28a-His6-MBP-TEV-CYP51A和pET28a-MBP-TEV-CYP51B-His6。经原核表达与多种纯化方法成功获得质量佳且纯度高的稻瘟菌CYP51A和CYP51B-His6单体蛋白，并分别与氯氟醚菌唑、烯唑醇及戊唑醇等抑制剂孵育获得复合体，稻瘟菌CYP51B蛋白与烯唑醇复合体在0.1 mol/L酒石酸钾钠、0.1 mol/LTris-HCl （pH 8.5）、0.4 mol/L水合硫酸镁结晶条件下长出晶体。
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| 关 键 词： | 稻瘟菌 CYP51蛋白 抑制剂 表达 纯化 结晶 |
| 收稿时间： | 2022/4/12 0:00:00 |
Expression and purification of CYP51 proteins from rice blast fungus Magnaporthe oryzae and optimization of crystallization conditions for the CYP51-inhibitors complexes |
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| Zhang Xiujuan,Zhang Feng.Expression and purification of CYP51 proteins from rice blast fungus Magnaporthe oryzae and optimization of crystallization conditions for the CYP51-inhibitors complexes[J].Acta Phytophylacica Sinica,2023,50(4):873-882. |
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| Authors: | Zhang Xiujuan Zhang Feng |
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| Institution: | College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu Province, China |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Magnaporthle oryzae CYP51 protein inhibitor expression purification crystallization |
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