| 摘 要： | 本研究旨在克隆猪转录因子ELF4基因,体外表达ELF4蛋白并制备抗该蛋白的多克隆抗体。采用RTPCR扩增猪ELF4基因,运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸序列特征,将其克隆至原核表达载体pET28a,构建重组表达载体pET28a-pELF4,转化Rosetta(DE3)菌株,在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达,重组pELF4蛋白(rpELF4)经纯化免疫鸡制备抗pELF4抗体。结果表明,pELF4开放阅读框为1 989bp(GenBank No.:KU097322),编码662个氨基酸,该基因与已经测定的人、牛、小鼠的ELF4的核苷酸相似性依次为89.4%、90.7%和81.1%,与牛等大动物的亲缘关系相对较近,与人和小鼠亲缘关系相对较远;结果显示,成功表达了重组蛋白pELF4,rpELF4分子量为95ku,该蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,在37℃条件下,以终浓度为0.8mmol·L-1IPTG诱导8h包涵体表达量达到最高。第4次免疫后第13天,鸡抗rpELF4抗体滴度达到1︰256 000倍以上。本试验利用原核表达系统成功制备了重组pELF4蛋白,并制备了免疫活性和特异性良好的鸡抗pELF4多克隆抗体,为该蛋白生物学功能及相关疾病研究提供了基础材料。
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