微滴式数字PCR定量检测鸡毒支原体方法的建立

为建立微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）定量检测鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）方法，以MG的mgpc基因序列为目的序列，在其保守区域内设计合成了1对特异性引物和1条探针，通过各反应条件优化，建立了检测MG的ddPCR方法，并测定了建立方法的特异性、敏感性以及重复性。结果显示：建立方法的最佳引物浓度为20 μmol/μL，探针浓度为10 μmol/μL，退火温度为55 ℃；该方法只检出MG，没有检出鸡滑液囊支原体、禽衣阿华支原体、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、禽偏肺炎病毒、禽呼肠孤病毒、鸡沙门氏菌和鸡大肠杆菌，且相互间没有交叉反应；本方法最低检测MG重组质粒标准品的检测限为3.9拷贝/μL。重组质粒标准品浓度在3.9~41 025拷贝/μL范围内，绘制的ddPCR绝对定量曲线与测得值呈良好的线性关系（R2 = 0.999）；3次重复检测试验结果的变异系数均小于5%。对采集的60份病鸡喉拭子、气囊拭子及肺样品进行MG检测，结果ddPCR方法的阳性检出率（15.0%）高于荧光定量PCR方法（13.3%）。结果表明，本研究建立的ddPCR方法定量检测MG特异性强，灵敏度高，重复性好，为绝对定量检测MG提供了技术手段。

Establishment of a Droplet Digital PCR for Quantitative Detection of Mycoplasma gallisepticum