| SYBR Green Ⅰ法洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系的建立 |
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| 引用本文： | 陈海一,迟德富,姚大彬,刘航,李晓灿,宇佳.SYBR Green Ⅰ法洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系的建立[J].中国农学通报,2013,29(12). |
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| 作者姓名： | 陈海一 迟德富 姚大彬 刘航 李晓灿 宇佳 |
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| 作者单位： | 东北林业大学生命科学学院,哈尔滨,150040 |
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| 基金项目： | 林业公益性行业科研专项"植物源杀虫剂开发与利用技术" |
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| 摘 要： | 为了建立洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,本实验采用MJ Research OpticonTM2型实时荧光定量PCR仪,利用SYBR Green Ⅰ染料法,根据GenBank上其他昆虫β-actin基因的保守序列设计引物,对PCR退火温度、引物浓度、模板浓度等各反应因子进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线进行分析.结果显示,在20μL体系下,当2×SYBRR Premix Ex TaqTM为10μL时,引物和cDNA模板的最佳浓度分别为1 μmol/L和50 ng/μL.最佳PCR反应程序为:94℃预变性30 s,44个循环包括94℃变性10s,45℃退火30 s,72℃延伸40 s,最后加做熔解曲线82℃1 s.结果表明,在洋虫不同发育时期β-actin基因表达水平基本稳定,因此β-actin基因可以作为洋虫实时荧光定量RT-PCR的内参基因.本研究成功建立了2-△△CT相对定量法的洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,并分析了优化PCR反应体系的重要性,建立的洋虫β-actin基因荧光定量RT-PCR方法简便、特异性强,该体系的建立可用于洋虫蜕皮相关基因表达差异的深入研究.
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| 关 键 词： | 洋虫 β-actin基因 荧光定量RT-PCR SYBR Green Ⅰ |
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