山羊RORα基因的克隆、表达载体构建及功能分析

旨在克隆山羊维甲酸相关孤儿受体α(RORα)基因并构建其真核表达载体，然后利用生物信息学工具系统分析RORα的生物学特性，最后对其在山羊生物钟系统中的作用机制进行初步探究。本研究以1只健康的12月龄雄性西农萨能奶山羊为试验动物，提取其肝组织总RNA，经逆转录PCR反转录为cDNA后，利用常规PCR扩增山羊RORα基因的编码区(coding sequence，CDS)片段，使用同源重组法将其与pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体相连接; 重组载体经PCR、酶切和测序鉴定后，将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gRORα; 将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gRORα质粒分别转染至HEK293T细胞后，通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)和蛋白质免疫印迹(western blotting，WB)技术检测山羊RORα的表达; 同时利用ExPASy、ProtScale等软件对山羊RORα基因进行系统的生物信息学分析。另外，使用同源重组法分别构建含有山羊生物钟基因BMAL1和NR1D1启动子片段的pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc及pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc的荧光素酶报告质粒，并通过双荧光素酶报告试验探究山羊RORα蛋白调控BMAL1和NR1D1基因启动子转录活性的作用机制。PCR、酶切和测序鉴定结果表明，pcDNA3.1-3HA-gRORα重组质粒构建成功; qPCR和WB结果显示，pcDNA3.1-3HA-gRORα转染组RORα基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA转染组(P < 0.01)。生物信息学分析结果显示，山羊RORα基因CDS区序列与绵羊、牛和猪的相似性较高，分别为97.5%、97.1%和95.2%。山羊的RORα蛋白是一种亲水性蛋白。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成，有信号肽的概率较小，无跨膜区; 三级结构与小鼠和人的RORα蛋白差异性极小，三者具有高度相似性。此外，PCR、酶切和测序结果表明，pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc和pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc重组质粒构建成功。双荧光素酶报告试验结果表明，山羊RORα蛋白可以显著上调山羊BMAL1和NR1D1基因启动子的转录活性。本研究成功构建了山羊RORα基因的真核表达载体，并证明了RORα蛋白可以正向调控山羊BMAL1和NR1D1基因的启动子活性，这为进一步探究山羊核受体RORα的功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了前期基础。