猪内源性反转录病毒5′非编码区启动子活性的分析

 【目的】构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒（PERV）5′非编码区（5′UTR）为启动子的萤光素酶表达载体，分析5′UTR的转录调控规律。【方法】将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上，转染瞬时表达细胞Cos-7，检测萤光素酶的表达。【结果】缺失R区的5′UTR显示出很强的启动子活性，U3重复区序列缺失的5′UTR启动子活性显著下降。UTR显示出较之LTR强的启动子活性。缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强。【结论】在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降；U3重复区序列表现出增强子的活性。在5′UTR的下游序列中，包括引物结合区(PBS)和前导序列(Leader)可能有某些转录因子的结合位点引起转录增强，同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可减少5′UTR的转录活性。     

广西巴马小型猪内源性反转录病毒进化年代分析

【目的】确定广西巴马小型猪内源性反转录病毒（PERV-BM）的进化年代。【方法】对先前扩增、测序获得的 9个PERV-BM的LTRs,一个PERV-BM全长基因组序列,登录号为HM159246及GenBank上发表的所有背景清楚的猪内源性反转录病毒（PERV）的LTRs及env序列进行分析。首先利用DAMBE软件对上述序列比对分析,合并同源性较高的,筛选有差异代表性的核酸序列的数据集。然后利用MEGA5.2软件Neighbor-Joining方法计算PERV-BM遗传进化关系。利用DAMBE软件对上述筛选的序列集进行替换饱和度计算,分析核酸进化速率的稳定性;利用MEGA5.2软件,通过最大相似法对筛选数据制作的遗传进化树进行分子钟行为分析。最后对广西封闭群内的广西巴马小型猪3′-LTR序列进行替代饱和度及分子钟分析,对符合分子钟行为的LTRs序列,以假设的恒定进化速率计算PERV-BM的进化年代。【结果】经过DAMBE软件分析后,选出80多个GenBank上发表的有代表性的env、LTRs序列数据集。对PERV-BM (HM159246) 序列全长遗传进化分析显示,PERV-BM与中国的PERV核酸序列EF133960和GU980187,荷兰的AF356697亲缘关系较近,与韩国的HQ540595和美国的AF038600和NC_003059亲缘关系则较远。利用DAMBE软件对筛选数据集替换饱和度检测结果显示,S和V值随PERV序列之间进化分歧的增加呈线性的增加。LTRs序列数据集替换饱和曲线呈线性关系,没有替换饱和现象发生,LTRs的进化随时间持续且稳定。数据集env序列替换饱和曲线不完全呈线性关系,表明env序列集进化速率不稳定。利用MEGA5.2的最大相似法对LTRs和env数据集的进化树进行分子钟行为检测结果显示,LTRs序列集接受分子钟假说,env进化不符合分子钟行为,这和不饱和度检测的结果一致。因此可用LTRs进化的近分子钟行为进行PERV进化年代的计算。利用DAMBE软件对广西封闭群内的广西巴马小型猪3′-LTR序列进行替代饱和度及分子钟分析结果显示,3′-LTR的进化符合分子钟行为可用于进化年代计算。假设以灵长类ERV的积累突变率,每个核苷酸每年的替换率2.3×10^-9-5.0×10^-9,计算PERV-BM约进化于3.3×10⁶-7.1×10⁶年前。【结论】PERV-BM进化年代与欧洲小型猪PERV进化时间7.6×10⁶年前相近。     

上海梅山猪封闭群内源性逆转录病毒的检测及亚型分析

为检测分析上海梅山猪携带猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)的情况,为该猪种作为器官移植供体的生物安全性提供现实依据,笔者从上海嘉定区梅山猪育种中心的梅山猪封闭群内随机采集45头猪的耳组织,并构建耳成纤维细胞系,利用PCR检测PERV前病毒核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(pol)以及囊膜基因(env)的基因组DNA,利用RT-PCR的方法检测mRNA表达状况。结果发现被检测的45份样品均携带完整的3种亚型的PERV前病毒DNA;RT-PCR结果显示,45份样品中有40份同时有PERV-A和PERV-B两种亚型的表达,还有5份样品仅检测到PERV-B亚型的表达,未检测到PERV-C亚型的表达。鉴于生物安全性方面的考虑,该猪种能否作为人异种移植的供体仍有待进一步商榷。     

半定量RT-PCR检测PERV mRNA在姜曲海猪不同器官与组织中的表达

猪内源性反转录病毒(PERV)为反转录病毒科哺乳动物C型反转录病毒属成员,它以前病毒DNA的形式整合进猪细胞基因组中,并随细胞染色体复制而复制.本试验利用半定量RT-PCR方法分析姜曲海猪的肝、心、胰、脾、肺、胆、腿肌等器官与组织中PERV基因3种亚型的mRNA表达情况.结果表明:在所检测的器官与组织中,PERV-A在肝中表达丰度最高,胰中表达丰度最低;PERV-和PERV-C均在腿肌中表达丰度最高,脾中表达丰度最低.     

猪内源性逆转录病毒对异种组织器官移植影响的研究进展

猪内源性逆转录病毒(Porcine en-dogenous retrovirus,PERV)是新发现的对人细胞具有感染性的且存在于正常猪体内的病毒,在异种组织器官移植过程中可能向人传播,直接威胁到接受移植者的健康甚至生命,这是异种组织器官移植首要克服的难题。由于PERV近年来才受到广泛关注,所以人们对PERV的分类,对人类和其他动物的危害性及病原的检测均不能完全确定。文章旨在提供上述几方面的研究现状,以期为PERV的深入研究奠定基础。PERV能影响移植受体的生殖,抑制受体免疫体系;对其他物种的细胞或活体都可能产生体外和体内感染性;目前有多种PERV检测方法,为受体和供体的病毒监控提供了依据。     

Simultaneous detection and subtyping of porcine endogenous retroviruses proviral DNA using the dual priming oligonucleotide system

The purpose of this study was to develop a multiplex PCR that can detect porcine endogenous retrovirus (PERV) proviral genes (pol, envA, envB, envC) and porcine mitochondrial DNA, using a dual priming oligonucleotide (DPO) system. The primer specifically detected the PERV proviral genes pol, envA, envB, envC, and porcine mitochondrial DNA only in samples of pig origin. The sensitivity of the primer was demonstrated by simultaneous amplification of all 5 target genes in as little as 10 pg of pig DNA containing PERV proviral genes and mitochondrial DNA. The multiplex PCR, when applied to field samples, simultaneously and successfully amplified PERV proviral genes from liver, blood and hair root samples. Thus, the multiplex PCR developed in the current study using DPO-based primers is a rapid, sensitive and specific assay for the detection and subtyping of PERV proviral genes.