用RAPD标记评价百合品种间遗传关系

本文从１３个百合品种种１野生种中分别提取了总ＤＮＡ，进行ＰＣＲ－ＲＡＰＤ分析，每个品种都得到了各自独特的带谱，通过对这些带谱的分析及数据的处理，并用计算机计算出百合品种间的遗传关系。结果表明，ＲＡＰＤ技术能用以鉴定百合品种间的遗传关系并推测其亲缘关系，本文对实验中遇到的一些问题进行了讨论。     

水稻AFLP指纹银染法显带研究

以转基因水稻为材料,对AFLP指纹银染技术及实验操作中的关键技巧做了比较详尽的叙述,取得了比较理想的实验结果。     

聚丙烯酰胺凝胶电泳的两种染色方法对SSR标记的影响

以高粱属约翰逊草和同源四倍体高粱四沈甜为指示材料,利用99对SSR引物比较了多态性检测中聚丙烯酰胺凝胶的两种染色方法,结果表明:由同一原理衍生出的两种染色方法有一定的差异,其中“强碱法”具有较强的适应性和稳定性,而且具有更高的效率,尤其在分子标记辅助选择中更适合。     

柿AFLP银染技术体系的建立

通过对各主要影响因素的研究,建立了适于柿AFLP分析的银染技术体系:酶切体系20μL总体积中含纯化后的DNA450ng,EcoRI和MseI各3U,37℃酶切4h;酶切完成后加入连接液,37℃连接10h(或过夜),然后65℃变性10min;连接产物稀释5倍用于预扩增,预扩增体系中EcoRI和MseI引物均不含选择性碱基;预扩增产物稀释5倍用于选择性扩增,选择性扩增体系中EcoRI和MseI引物均含3个选择性碱基,选择性扩增完成后,加入10μLLoadingbuffer,95℃变性10min,立即冰浴;取6 5μL变性后的选择性扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,电泳完毕后,对胶板进行固定、脱色、水洗、银染、冲洗、显影、定影及干燥等银染程序。     

银染mRNA差异显示法克隆柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)抗药性相关基因

以柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）敏感株、地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株孢子化卵囊为材料，用银染mRNA差异显示方法筛选和克隆与球虫抗药性相关的基因。首先提取这3个虫株孢子化卵囊的总RNA为模板．用Oligo（dT）12GG为锚定引物和2个10碱基随机引物组合进行RTPCR，产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染。分别切取5务差异条带，进行2次PCR扩增，产物回收后与PGEM—T—easy Vector连接转化。经PCR鉴定正确后，再进行斑点杂交试验、序列分析和同源性比较。结果发现，地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株分离的差异片段中都有2个cDNA片段（可能为新的基因片段），这为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生的分子机理奠定了一定的基础。     

蜡梅AFLP-银染体系的建立与优化

为了建立蜡梅AFLP-银染的优化体系,采用EcoRI和MseI 2种限制性内切酶酶切组合,对该2种酶的用量、酶切时间、预扩增与选择扩增中的Mg2 浓度、Taq DNA聚合酶的用量、引物的浓度以及预扩增产物的稀释倍数等因素进行了多水平的筛选,同时探讨了温度及聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的电流强度等因素对胶图的影响。结果表明:用5 U限制性内切酶酶切4 h便能在40μL的反应体系中完全切割500 ng的总DNA,酶切连接产物稀释10倍后在含有1.5 mmol/L Mg2 1、U Taq、预扩增引物E A和M C分别为40 ng的20μL反应体系中进行预扩增,将预扩增产物稀释30倍后在含有1.5 mmol/L Mg2 、0.6 U Taq、选择扩增引物E 3为30 ng、M 3为60 ng的20μL的体系中进行选择性扩增,能够得到质量比较好的AFLP胶图。此外,在进行PAGE电泳和硝酸银染色,将电泳的温度控制在50℃左右,电流控制在45~60 mA左右能提高胶图的质量。利用这种优化的反应体系,成功地评价了40个蜡梅基因型的遗传多样性,6对选择扩增引物组合表现出较高的稳定性、清晰度和多态性,它们分别是:E-AAC/M-CCC,E-ATC/M-CCC,E-AGA/M-CAG,E-AAA/M-CAC,E-ATA/M-CCA,E-ATT/M-CCA。     

AFLP荧光标记和银染技术的比较分析

为了建立准确、高效、实用的AFLP体系和方法,采用改进的CTAB-DNA提取方法从披碱草的嫩叶中提取降解少、样品纯度高、蛋白去除干净、不含PCR反应抑制剂及其他酶反应抑制剂的总DNA.选取3对引物扩增,采用AFLP荧光标记和银染法对披碱草全基因组多态性进行了分析,其中荧光标记法得到231条条带,银染法得到75条条带,平均每条引物荧光标记技术比银染法多得到52条条带,多态比率是银染法的1.8倍.据此认为荧光标记法检测效果较为理想,适于进行披碱草遗传多样性的分析和研究.     

牡丹基因组AFLP银染反应体系的建立和优化

采用改进的SDS方法,从牡丹成熟叶片中提取基因组DNA,所得DNA样品的A260/A280值在1.7～1.8之间,琼脂糖凝胶电泳主带清晰、DNA纯度高、较少降解、不含酶反应抑制剂,可被MseⅠ和PstⅠ两种限制性内切酶完全酶切.通过酶切连接、预扩增、选择性扩增、银染等试验过程,成功建立了牡丹品种AFLP银染反应体系,得到了清晰的指纹图谱.对扩增结果进行聚类分析,得到了23个牡丹品种的聚类分析图.     

微卫星产物变性与非变性PAGE-银染方法比较

用哲罗鱼的微卫星引物对哲罗鱼的2个微卫星位点进行PCR扩增。将扩增产物在变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上电泳,银染后发现微卫星扩增产物在二者上的电泳结果存在明显差异。在非变性凝胶中存在较多非特异条带,而在变性凝胶中微卫星扩增产物条带清晰,易于鉴定。     

运用银染mRNA差异显示方法分析杂交水稻红莲优6号基因表达差异

运用非同位素银染mRNA差异显示方法，分析红莲型杂交水稻组合基因表达差异。以杂交水稻及其亲本三系(YTA、YTB、9311)三叶一心期叶片RNA为模板采用锚定引物5’dTl2MN 3’和随机引物组合，进行反转录差异显示PCR。经5．6％测序胶电泳分离后用银染方法显示差异DNA条带，在直观下，从凝胶中回收差异条带并进行再扩增，2％琼脂糖电泳得到了DNA的单一带型。