九香虫溶菌酶CcLys2的基因克隆与生物信息学分析

九香虫Coridius chinensis是一种药食两用的资源昆虫,溶菌酶是一种能水解细菌中黏多糖的胞壁质酶。本研究克隆了一种九香虫溶菌酶基因CcLys2,其cDNA长1096 bp,包含一个长672 bp的开放阅读框,编码223个氨基酸(aa)。九香虫溶菌酶蛋白CcLys2的N端包含一段由13 aa组成的信号肽,成熟CcLys2是一种分子量为23.34 kDa的分泌型亲水蛋白。成熟CcLys2形成7个α-螺旋和2个β-折叠片的三维分子结构,并由4个二硫键稳定其构象。同源性和聚类分析表明,CcLys2与来自斯氏珀蝽Plautia stali的C-型溶菌酶的亲缘关系最近。生物信息学分析结显示,CcLys2很可能属于具有消化作用的C-型溶菌酶。本研究为今后进一步阐明CcLys2基因的功能及开发新型抗菌药物奠定基础。     

人溶菌酶密码子优化及其在牛乳腺细胞中高效表达

【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子（LYZop22）和全局密码子(LYZop)分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体（pGL3-LYZcw/op22/op）和人溶菌酶过表达载体（pcDNA-LYZcw/op22/op）,将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞（BFFC）和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异。依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子（RSCU>1.5）和7个低频密码子（RSCU<0.5）对人溶菌酶基因密码子进行优化并转染多种细胞进行表达效果分析。荧光素酶分析发现,相比野生型溶菌酶密码子（LYZcw）,翻译起始区密码子优化类型LYZop22分别在BMEC、BFFC细胞中提高1.48倍（P<0.01）和1.30倍（P>0.05）;而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍（P<0.01）和2.44倍（P<0.01）,说明密码子优化能明显提高人溶菌酶在多种细胞中表达量。实时荧光定量PCR结果表明,LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC细胞中分别提高了2.08倍（P<0.05）和1.5倍（P>0.05）,而LYZop则分别提高了22倍（P<0.01）和17.8倍（P<0.01）,mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关。Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量。上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果。【结论】通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础。     

溶菌酶对犊牛腹泻和生长性能的影响

[目的]本试验研究溶菌酶在使用量不同情况下,对犊牛腹泻和生长性能的影响。[方法]选择无病、健康、体型近似的犊牛100 头,随机分为4 组,每组25 头,分别为对照组、低剂量组（Ⅰ组、1 g/头·天）、中剂量组（Ⅱ组、3 g/头·天）、高剂量组（Ⅲ组、5 g/头·天）,试验期30 天。在试验开始和结束时,观察犊牛粪便、腹泻、体重、体尺变化,并记录。[结果]试验期溶菌酶对犊牛的粪便评分有影响,1~30 天的粪便评分Ⅲ组显著低于对照组（P<0.05）,且Ⅲ组比对照组降低12.5%;1~15 天时腹泻率差异显著（P<0.05）,Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组与对照组相比分别降低23.02%、41.81%、53.64%,表明溶菌酶使用量多,腹泻效果更加明显;添加溶菌酶的Ⅱ组和Ⅲ组犊牛的平均日增重均显著高于对照组（P<0.05）,分别提高9.6%、12.0%;Ⅲ组胸围显著高于对照组,高3.0%。[结论]溶菌酶使用到合适剂量,不仅能降低犊牛腹泻率,还能促进犊牛的生长性能。     

共表达内溶素和人溶菌酶基因的重组腺病毒构建

为研究内溶素SAL-2和人溶菌酶h LYZ的联合抑菌作用,本研究通过PCR方法分别从携带SAL-2和h LYZ基因的质粒中扩增目的片段,连接至腺病毒穿梭载体的多克隆位点上,构建重组穿梭载体p Shuttle-SAL和p Shuttle-LYZ。成功构建的重组穿梭质粒与Ad-easy骨架质粒在BJ5183中发生同源重组,重组得到的阳性重组腺病毒载体在脂质体介导下转染HEK293细胞,包装产生重组腺病毒Ad-SAL、Ad-LYZ、Ad-SALLYZ和对照重组腺病毒Ad-GFP,通过RT-PCR和Western blot方法检测mR NA和蛋白表达后,将构建的重组腺病毒进行扩增纯化并测定病毒滴度。结果表明,成功构建的重组腺病毒感染细胞后,SAL-2和h LYZ基因的mR NA均有表达,Western blot分别检测到28.6 ku和14.7 ku目的蛋白条带。扩增纯化后经TCID50方法检测病毒滴度分别为108.17TCID50/mL、108.50TCID50/mL、108.63TCID50/mL和107.60TCID50/mL。表明成功构建包装的重组腺病毒对HEK293细胞具有较强的感染能力,可稳定介导SAL-2基因和h LYZ基因在HEK293细胞中的表达。     

溶菌酶、海藻酸钠与壳聚糖复配溶液对油桃的保鲜效果

以油桃为试材,采用溶菌酶、海藻酸钠和壳聚糖复配保鲜液对油桃进行保鲜处理,通过测定失重率、腐烂指数、感官品质、呼吸强度、可溶性糖及维生素C含量等指标,研究保鲜液对油桃的保鲜效果,以期为油桃的实际贮藏和天然保鲜剂的运用提供实践参考。结果表明:在室温下,复配保鲜液1.0%的壳聚糖、0.07%的溶菌酶和1.0%的海藻酸钠对油桃保鲜效果最好,能有效延缓失重率的上升及可溶性糖、维生素C含量的下降,降低了果实腐烂指数及呼吸强度。     

溶菌酶对2-3月龄肉兔生产性能、免疫及屠宰性能的影响

试验旨在研究溶菌酶对肉兔生产性能、免疫及屠宰性能的影响。选择60日龄新西兰兔60只,随机分为3组,Ⅰ组饲喂基础日粮,Ⅱ、Ⅲ组分别在基础日粮中添加100g/t杆菌肽锌、100g/t溶菌酶。结果表明:各组采食量差异不显著(P>0.05),Ⅲ组日增重显著高于Ⅰ组(P<0.05),而饲料增重比显著低于Ⅰ组(P<0.05);与Ⅰ组相比Ⅲ组显著提高了胸腺重和胸腺指数(P<0.05);Ⅲ组半净膛率和全净膛率高于Ⅰ组,但是差异不显著(P>0.05)。试验表明,在肉兔饲粮中添加溶菌酶可以提高肉兔生产性能和免疫器官指数,有提高屠宰性能的趋势,可以作为抗生素的替代选择之一。     

不同水平抗草甘膦转基因豆粕日粮对AA肉仔鸡免疫功能的影响

试验研究不同抗草甘膦转基因豆粕添加水平日粮对AA肉仔鸡免疫功能的影响。试验选用720只1日龄的AA肉仔鸡,随机分成4个处理组,每个处理5个重复,分别饲喂含36%和27%的转基因豆粕和非转基因豆粕日粮。比较各组试验鸡免疫指标中血清溶菌酶活性、新城疫抗体滴度、外周淋巴细胞转化率和T淋巴细胞亚群。结果表明:42 d的36%转基因组与36%常规豆粕组间法氏囊指数有显著差异(P<0.05),42 d 27%转基因豆粕组与27%常规豆粕组间球蛋白含量差异显著(P<0.05),其他指标均无显著差异(P>0.05)。结果显示,试验期间不同水平抗草甘膦转基因豆粕日粮对AA肉仔鸡免疫功能没有影响。     

木瓜蛋白酶的酶学特性及其在饲料工业中的应用

<正>木瓜蛋白酶类主要存在于番木瓜的根、茎、叶和果实中,以未成熟的果实乳汁中含量最高(叶启腾等,1999;赵元藩等,1999;乙引等,2000)。由于木瓜蛋白酶具有很强的分解蛋白质能力,并且有水解酰胺键和酯键的特性,因而广泛应用于医药、食品、纺织、制革、饲料及染料等工业(吴显荣等,1988)。     

禽蛋溶菌酶的萃取加工

溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称为细胞壁溶解酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,是英国细菌学家弗来明于1922年发现的。在自然界中,溶菌酶普遍存在于鸟类和家     

止痢草精油对感染嗜水气单胞菌罗非鱼免疫功能的影响

嗜水气单胞菌是淡水鱼流行性败血症的主要致病菌。在采用添加不同剂量的止痢草精油的饲料投喂3周后,对罗非鱼腹腔注射嗜水气单胞菌,在其攻毒后不同时间取血,通过NBT阳性细胞数量、白细胞数量以及血清溶菌酶活力的变化趋势来研究止痢草精油及病原菌感染对鱼类非特异性免疫功能的相互影响。结果表明,在罗非鱼感染嗜水气单胞菌后72h内,白细胞数量、NBT阳性细胞数量以及血清溶菌酶活力依感染浓度不同,呈现先增加后降低的趋势,而添加了止痢草精油试验组的这3项指标也是先出现增加的趋势,但降低幅度和速度减小,同时到后期恢复到正常水平的速度更快。说明嗜水气单胞菌与罗非鱼非特异性免疫功能之间呈现一定的时间效应,而止痢草精油对罗非鱼的非特异性免疫机能可能有协同增强功效。